2023 Fiscal Year Research-status Report
クライオ電子線トモグラフィーによる脂質交換輸送ゾーンの形態・機能解析
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20KK0159
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
中津 史 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (50360607)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
河嵜 麻実 新潟大学, 医歯学系, 特任講師 (10609358) [Withdrawn]
高杉 俊之 新潟大学, 医歯学系, 特任助教 (40823224)
伊藤 泰行 新潟大学, 医歯学系, 助教 (70710573)
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| Project Period (FY) |
2020-10-27 – 2025-03-31
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| Keywords | クライオ電子線トモグラフィー / 脂質輸送交換ゾーン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
海外渡航規制によりクライオ電子線トモグラフィー解析を行うことができなかったため、通常の電子顕微鏡を用いた手法に切り替えて解析を行ってきた。GFP融合タンパク質として脂質輸送交換ゾーンに局在する分子を低レベルで発現させた細胞を用いて、事前に決定した固定条件でサンプル調整を行うことで再現よく脂質輸送交換ゾーンの電子顕微鏡像を捉えることに成功した。そこで、脂質輸送交換ゾーンに局在する分子GFP融合タンパク質が適度に分散し、正常な局在を示す細胞をまず共焦点顕微鏡により画像取得し、その蛍光像に重ね合わせる手法で電子顕微鏡解析を試みた。このCLEM手法により、脂質輸送交換ゾーン局在分子のGFP蛍光共焦点画像とほぼ一致する形で、小胞体と細胞膜が接する脂質輸送交換ゾーンの電子顕微鏡像を取得することに成功した。次に、さらに詳細かつ広域の微細構造を解析するために、連続切片を作成し、それらの電子顕微鏡を重ね合わせることで３次元構造情報の取得を試みた。これは、熟練した協力研究者との共同研究により行っている。扁平な領域の電子顕微鏡像を再現性良く取得するために、現在、条件検討を行っている。また、クライオ電子線トモグラフィー解析に向けて、脂質輸送交換ゾーン局在分子の安定細胞株について、野生型、ER局在変異体、細胞膜局在変異体、および脂質輸送機能欠失変異体の樹立を行った。そして、それらの細胞の固定条件の決定を行った。さらにノックダウンによる表現型解析についても並行して行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
通常の電子顕微鏡解析により、小胞体と細胞膜が接する脂質輸送交換ゾーンの微細構造の取得に成功した。また、CLEM手法を用いた電子顕微鏡解析にも着手し、脂質輸送交換ゾーンの微細構造取得に成功している。一方で、当該年度も海外渡航規制のために、クライオ電子線トモグラフィー解析による超微細構造の解析を行えず、次年度へ持ち越さなくてはならない状況となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度は、CLEMによる微細構造の解析について、特に３次元微細構造の解析を中心に進める。また、海外での共同研究者とのクライオ電子線トモグラフィーによる超微細構造の解析が行えるよう注力して計画を遂行する。
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| Causes of Carryover |
海外渡航規制のため、海外協力研究者との共同研究を実施できなかったため、それに関わる費用を次年度に持ち越した。今年度は、海外での共同研究を本来の計画に沿って実施する。
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