Establishment of lung cancer organoids and their practical application in clinical practice

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20KK0202
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 眞庭 謙昌 神戸大学, 医学研究科, 教授 (50362778)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 青井 貴之 神戸大学, 科学技術イノベーション研究科, 教授 (00546997) ; 法華 大助 神戸大学, 医学研究科, 特命講師 (80715459)
• Project Period (FY): 2020-10-27 – 2024-03-31
• Keywords: 肺癌 / 癌幹細胞 / 肺癌オルガノイド / 鶏卵漿尿膜培養

Outline of Annual Research Achievements

第１に、鶏卵漿尿膜培養法を用い、我々が開発した人工肺癌幹細胞：induced lung cancer stem cell like cell (iLCSC)から樹立した人工肺癌オルガノイドを培養に供し、浸潤や血管新生を始めとする癌微小環境の表現型；phenotypeを分析し、鶏卵漿尿膜培養における人工肺癌オルガノイド研究の優位性を明らかにした。第２に、患者検体から採取された腫瘍組織、特に重喫煙者の肺癌の腫瘍組織で鶏卵漿尿膜培養を行った。
方法として、 K-ras変異陽性の原発性肺腺癌細胞株であるA549細胞A549細胞に体細胞初期化因子(OCT 3/4, SOX2, KLF4)の導入を行い誘導型肺癌幹細胞(induced Lung cancer stem like cell; iLCSC)を作成し、ヒト臍帯静脈内皮細胞、ヒト間葉系幹細胞を混合培養し、人工肺癌オルガノイドを作成し、漿尿膜上で約１週間培養を行い、R N A抽出、組織固定標本を作成する。また超感度カメラを用いて血管新生をライブイメージングにより補足した。さらに、有精鶏卵の漿尿膜上に人工肺癌オルガノイドを移植する。培養中に超高倍率の血流スコープ(TOKU Capillaro)で移植片周囲の微細な血管の形状や血流を確認した。培養後、移植部位の固定標本を作製し組織学的に移植片の増殖、浸潤、転移を評価、培養の前後でRNA抽出行いトランスクリプトーム解析を行った。
結果として、鶏卵漿尿膜培養を用い、肺腺癌の血管新生に関わる因子としてTIPARPを同定した。そのメカニズムはVEGFを介さず、細胞外マトリックスをリモデリングを介し血管新生を誘導した。鶏卵漿尿膜培養は、細胞外マトリクスのリモデリングを介した血管新生を評価できる実験系である。肺腺癌においてTIPARPの高発現は血管新生にかかわる可能性があることが示された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これまで、型コロナウイルス感染拡大に伴う渡航制限により、国際共同研究の相手先であるトロント大学呼吸器外科・病理部へ赴いておこなう研究が十分に消化できていなかったが、制限の緩和により、当該年度後半に当方からトロントでの打合せ、研究室入室が可能となり、計画を実施した。

Strategy for Future Research Activity

今後は、両施設の研究者の行き来を加速して、研究の推進を図る。さらに、神戸大学からは大学院生を派遣し、相手先での研究の加速を図る。
具体的には、腫瘍の進展・転移の評価のために、組織透過性の高い近赤外光を発する発光システム(AkaBLI)を活用し、肺癌オルガノイドのマウス体内での進展、転移の現象を、高感度かつ定量的に評価する。まず肺癌オルガノイドの同所移植マウスモデルと皮下移植マウスモデルの比較により、癌微小環境が肺癌オルガノイドの進展・転移・抗癌剤感受性に与える影響を解析し、同所移植マウスモデルの有用性について明らかにする。さらに転移部からの癌オルガノイドの再樹立を行い、元の肺癌オルガノイドとのGenetic/Epigeneticな比較、Single cell RNA sequencingによる単細胞レベルの比較を行い、転移を生じたクローンに有意な変化があるかを明らかにする。本手法の確立は、転移抑制をターゲットにした新規薬剤の開発に繋がると考える。

Causes of Carryover

新型コロナウイルス感染拡大に伴う渡航制限により、2020年度から2022年度前半にかけて国際共同研究の相手先であるトロント大学呼吸器外科・病理部への渡航、研究実施ができなかったため。

Research Products

• [Presentation] Radiological features predict patient derived xenograft engraftment in lung adenocarcinomas (2023)
  • Author(s): Hiroyuki Ogawa, Takamasa Koga, Nhu-An Pham, Nicholas Bernards, Alexander Gregor, Yuki Sata, Shinsuke Kitazawa, Yoshihisa Hiraishi, Tsukasa Ishiwata, Masato Aragaki, Fumi Yokote, Andrew Effat, Kate Kazlovich, Quan Li, Katrina Hueniken, Ming Li, Yoshimasa Maniwa, Ming-Sound Tsao, Kazuhiro Yasufuku
  • Organizer: AATS 2023; American Association for Thoracic Surgery Annual Meeting
  • Int'l Joint Research