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2021 Fiscal Year Research-status Report

Analysis of microglia-induced glaucoma at single cell level

Research Project

Project/Area Number 20KK0366
Research InstitutionUniversity of Yamanashi

Principal Investigator

篠崎 陽一  山梨大学, 大学院総合研究部, 准教授 (10443772)

Project Period (FY) 2021 – 2023
Keywordsグリア / 緑内障 / 1細胞RNAシークエンス
Outline of Annual Research Achievements

本年度は、国際共同研究用のマウスの準備と1細胞解析のための細胞分離条件の基礎検討並びに1細胞分離とシークエンスを完了した。現在、共同研究先であるロンドン大学へのマウス輸送が困難な状況であったため、Chromium (10x Genomics社)を用いた1細胞分離は共同研究先である生理学研究所にて行う事とした。所属機関にて事前に若齢マウス組織を用いて1細胞分離での細胞生存率を最適化したものの、共同研究先において実際に解析を行う加齢組織で細胞分離を行ったところ、著しく生存率が低下した。問題を解決するために分離条件を調整し、1細胞分離を完了し、ライブラリ作成およびシークエンスに成功した。現在情報解析を進めている。また、網膜ではP2Y6受容体遺伝子は主にミクログリアに発現している事を明らかにした。ミクログリアの維持に必須であるColony Stimulating Factor 1 (CSF1)受容体に対する拮抗薬であるPLX5622の投与によりミクログリアの性質をリセットすると網膜の細胞老化遺伝子の発現が正常化できる事を発見した。従って、本モデルマウスにおける緑内障発症の責任細胞がミクログリアであり、本細胞種の異常を正常化する事によって緑内障の発症や進行を制御できる可能性が高いと考えられた。また、我々が最近開発した、非侵襲的ミクログリア移植法を用いて、ミクログリアを用いた細胞治療が緑内障の新たな治療法となり得るかを検証する。今後の1細胞RNAシークエンスの解析では、ミクログリア画分の解析を進めて発症に係る分子機構の解明を目指す。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

緑内障で最も影響を受けやすい網膜神経節細胞の生存率を向上させるため、Cold Dissociation法(Adam et al. Development 2017)を用いて条件検討を行った。酵素濃度、反応時間、trituration条件など複数のパラメーターを調節しながら条件を最適化した。網膜では良好に細胞分離ができたものの、視神経のような脂質が豊富に含まれる組織では全く酵素消化ができず、従来法(37℃、パパイン処理)の方が良好であった。本条件では、3か月齢マウス網膜から分離した細胞の95%以上が生存できる結果となった。初回の1細胞分離は共同研究者の研究室(生理学研究所)にて行ったが、加齢マウス(12カ月齢)であった事や使用する遠心機の条件などが異なっていたためか、生存率が非常に悪く、その後のステップに進むことができなかった。実験条件の再調整を行い、生存率が向上したためライブラリ作成とシークエンスを完了した。本研究ではP2Y6KOマウスを緑内障モデルとして用いているため、1細胞RNAシークエンスと並行して網膜のP2Y6受容体がどの細胞に発現するかを磁気ビーズ分離法とqPCRで検討を行った。
CD11b陽性細胞とその他の細胞種で検討したところ、ミクログリア画分で100倍以上の発現を認めた。加齢P2Y6KOマウスでは細胞老化マーカー遺伝子の発現が上昇しており、CSF1受容体拮抗薬PLX5622投与によりミクログリアの性質をリセットするとこれらの発現が正常化した。つまり、ミクログリアが緑内障モデルマウス網膜における細胞老化を制御する責任細胞であると考えられた。

Strategy for Future Research Activity

現在までの結果から、網膜ではP2Y6受容体は主にミクログリアに発現すると考えられた。ミクログリアのP2Y6受容体欠損と緑内障発症との因果関係を明らかにするため、1細胞RNAシークエンスでは主にミクログリアフラクションの解析を進める予定である。近年、細胞老化と緑内障との関連に注目が集まっており、脳の神経変性疾患モデルではグリアが細胞老化を生じて神経変性を惹起する事が報告されている (Bussian et al. Nature 2018)。我々のモデルマウスにおいて観察された網膜組織細胞老化は、CSF1受容体アンタゴニストを用いたミクログリアリセットによって消失した。従って、グリア自身またはグリアが制御する細胞老化が緑内障発症・進行を規定する可能性は十分考えられる。この点を今後検証していく。グリア誘導性緑内障発症仮説を検証するもう1つの方法として、ミクログリアの置換によって緑内障症状を改善できるかどうかを検証する事である。我々は最近、経鼻的にミクログリアを脳へと移植する方法(Parajuli et al. GLIA 2021)を開発した。本手法は、免疫抑制薬や免疫不全動物を使用せずに、脳への非侵襲的ミクログリア移植を可能とする画期的な方法である。予備検討の結果、本手法を用いる事によって網膜へも非侵襲的にミクログリアを移植する事に成功した。P2Y6KOマウスに野生型ミクログリアを移植し、緑内障の発症・進行に対する効果を検証する予定である。また、上述の通り、ミクログリアが緑内障モデルマウス網膜の細胞老化を規定する責任細胞である事から、どのようにミクログリアを制御する事で細胞老化を制御できるか、そのメカニズムについてさらに詳細を検討する予定である。

  • Research Products

    (22 results)

All 2022 2021

All Journal Article (7 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Peer Reviewed: 7 results,  Open Access: 1 results) Presentation (15 results) (of which Int'l Joint Research: 5 results,  Invited: 1 results)

  • [Journal Article] The Mlc1 Promoter Directs Muller Cell-specific Gene Expression in the Retina2022

    • Author(s)
      Danjo Yosuke、Shinozaki Youichi、Natsubori Akiyo、Kubota Yuto、Kashiwagi Kenji、Tanaka Kenji F.、Koizumi Schuichi
    • Journal Title

      Translational Vision Science & Technology

      Volume: 11 Pages: 25~25

    • DOI

      10.1167/tvst.11.1.25

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Transient astrocytic mGluR5 expression drives synaptic plasticity and subsequent chronic pain in mice2022

    • Author(s)
      Yosuke Danjo, Eiji Shigetomi, Yukiho J. Hirayama, Kenji Kobayashi, Tatsuya Ishikawa, Yugo Fukazawa, Keisuke Shibata, Kenta Takanashi, Bijay Parajuli, Youichi Shinozaki, Sun Kwang Kim, Junichi Nabekura, and Schuichi Koizumi
    • Journal Title

      JEM

      Volume: 219 Pages: e20210989

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Development of a label-free ATP image sensor for analyzing spatiotemporal patterns of ATP release from biological tissues2021

    • Author(s)
      Doi Hideo、Parajuli Bijay、Horio Tomoko、Shigetomi Eiji、Shinozaki Youichi、Noda Toshihiko、Takahashi Kazuhiro、Hattori Toshiaki、Koizumi Schuichi、Sawada Kazuaki
    • Journal Title

      Sensors and Actuators B: Chemical

      Volume: 335 Pages: 129686~129686

    • DOI

      10.1016/j.snb.2021.129686

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Reactive astrocyte-driven epileptogenesis is induced by microglia initially activated following status epilepticus2021

    • Author(s)
      Sano Fumikazu、Shigetomi Eiji、Shinozaki Youichi、Tsuzukiyama Haruka、Saito Kozo、Mikoshiba Katsuhiko、Horiuchi Hiroshi、Cheung Dennis Lawrence、Nabekura Junichi、Sugita Kanji、Aihara Masao、Koizumi Schuichi
    • Journal Title

      JCI Insight

      Volume: 6 Pages: e135391

    • DOI

      10.1172/jci.insight.135391

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Adenosine A2B receptor down‐regulates metabotropic glutamate receptor 5 in astrocytes during postnatal development2021

    • Author(s)
      Tanaka Masayoshi、Shigetomi Eiji、Parajuli Bijay、Nagatomo Hiroaki、Shinozaki Youichi、Hirayama Yuri、Saito Kozo、Kubota Yuto、Danjo Yosuke、Lee Ji Hwan、Kim Sun Kwang、Nabekura Junichi、Koizumi Schuichi
    • Journal Title

      Glia

      Volume: 69 Pages: 2546~2558

    • DOI

      10.1002/glia.24006

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Transnasal transplantation of human induced pluripotent stem cell‐derived microglia to the brain of immunocompetent mice2021

    • Author(s)
      Parajuli Bijay、Saito Hiroki、Shinozaki Youichi、Shigetomi Eiji、Miwa Hiroto、Yoneda Sosuke、Tanimura Miki、Omachi Shigeki、Asaki Toshiyuki、Takahashi Koji、Fujita Masahide、Nakashima Kinichi、Koizumi Schuichi
    • Journal Title

      Glia

      Volume: 69 Pages: 2332~2348

    • DOI

      10.1002/glia.23985

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Loss of P2Y1 receptors triggers glaucoma‐like pathology in mice2021

    • Author(s)
      Hamada Kentaro、Shinozaki Youichi、Namekata Kazuhiko、Matsumoto Mami、Ohno Nobuhiko、Segawa Takahiro、Kashiwagi Kenji、Harada Takayuki、Koizumi Schuichi
    • Journal Title

      British Journal of Pharmacology

      Volume: 178 Pages: 4552~4571

    • DOI

      10.1111/bph.15637

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Loss of ABCA1 in astrocytes causes normal tension-glaucoma-like optic neuropathy.2021

    • Author(s)
      Shinozaki Y, Namekata K, Kashiwagi K, Ohno N, Harada T, Koizumi S
    • Organizer
      ARVO2021
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Deficiency of P2Y1 receptor induces hypertensive glaucoma-like phenotypes in mice.2021

    • Author(s)
      Hamada K, Shinozaki Y, Namekata K, Ohno N, Segawa T, Harada T, Kashiwagi K, Koizumi S
    • Organizer
      ARVO2021
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Astrocyte Dysfunction induced by ABCA1 Deficiency Causes Normal Tension Glaucoma-like Phenotypes in Mices2021

    • Author(s)
      Shinozaki Y
    • Organizer
      2021SLDDDRS Webinar Series
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Astrocytes trigger early remodeling of optic nerve head in novel model of normal-tension glaucoma2021

    • Author(s)
      篠崎陽一、行方和彦、柏木賢治、大野伸彦、繁冨英治、原田高幸、小泉修一
    • Organizer
      第125回日本眼科学会総
  • [Presentation] P2Y1 receptor dysfunction causes ocular hypertension and loss of retinal ganglion cells2021

    • Author(s)
      濱田 健太郎、篠﨑 陽一、行方 和彦、大野 信彦、原田 高幸、柏木 賢治、小泉 修一
    • Organizer
      第125回日本眼科学会総
  • [Presentation] Astrocytic mGluR5 regulates microglial engulfment during postnatal development, which fates a lifelong cortical circuits.2021

    • Author(s)
      Danjo Y, Shinozaki Y, Dewa K, Segawa T, Shigetomi E, Koizumi S.
    • Organizer
      第44回日本神経科学大会/第一回CJK国際会議
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Impaired glial ABCA1 causes age-associated degeneration of retinal ganglion cells and glaucoma-like pathologies.2021

    • Author(s)
      Shinozaki Y, Namaketa K, Kashiwagi K, Ohno N, Segawa T, Shigetomi E, Harada T, Koizumi S.
    • Organizer
      第44回日本神経科学大会/第一回CJK国際会議
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] P2Y1受容体活性化はeNOSを介して眼圧を下降させる2021

    • Author(s)
      濱田健太郎、篠崎陽一、行方和彦、大野伸彦、原田高幸、柏木賢治、小泉修一
    • Organizer
      第144回日本薬理学会関東部会
  • [Presentation] アストロサイトABCA1欠損による視神経炎症及び正常眼圧緑内障の誘導2021

    • Author(s)
      篠崎陽一、行方和彦、大野伸彦、繁冨英治、瀬川高弘、柏木賢治、原田高幸、小泉修一
    • Organizer
      第94回日本生化学会大会
  • [Presentation] P2Y1受容体作動薬の新規緑内障治療薬としての可能性2021

    • Author(s)
      濱田健太郎、篠崎陽一、行方和彦、大野伸彦、原田高幸、柏木賢治、小泉修一
    • Organizer
      第41回日本眼薬理学会年会
  • [Presentation] 網膜アストロサイトの異常による正常眼圧緑内障様症状の誘導2021

    • Author(s)
      篠崎陽一、行方和彦、大野伸彦、繁冨英治、瀬川高弘、柏木賢治、原田高幸、小泉修一
    • Organizer
      第41回日本眼薬理学会年会
  • [Presentation] Elucidation of glia-caused neurodegeneration by glial lipid decoding.2021

    • Author(s)
      篠崎陽一、Alex Leung、行方和彦、大野伸彦、繁冨英治、瀬川高弘、柏木賢治、原田高幸、大沼信一、小泉修一
    • Organizer
      第3回学術変革(A)グリアデコード領域班会議
  • [Presentation] 網膜アストロサイトは緑内障の発症過程において炎症を惹起する2021

    • Author(s)
      篠崎陽一、Alex Leung、行方和彦、大野伸彦、繁冨英治、瀬川高弘、柏木賢治、原田高幸、大沼信一、小泉修一
    • Organizer
      第95回日本薬理学会年会
  • [Presentation] ミューラー細胞におけるP2Y1受容体欠損は緑内障の表現型を示す2021

    • Author(s)
      濱田健太郎、篠崎陽一、行方和彦、大野伸彦、原田高幸、柏木賢治、小泉修一
    • Organizer
      第95回日本薬理学会年会
  • [Presentation] 臨界期アストロサイトは、ミクログリアによる貪食を制御する事で大脳皮質神経回路を形成する2021

    • Author(s)
      壇上洋右、篠崎陽一、出羽健一、小林健司、瀬川高弘、繁冨英治、小泉修一
    • Organizer
      第95回日本薬理学会年会

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Published: 2022-12-28  

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