| Research Abstract |
本研究課題の目的は,試験管内で相同組換えを制御して利用することにより,人工的に新規遺伝子,新規タンパク質を創出する基盤技術を構築することである.昨年度までに試験管内相同組換えに必要と考えられるタンパク質群(RecA, RecF, RecJ, RecO, RecR, RecX, SSB)の大量調製を終え,それら蛋白質群を用いて相同組換え反応における2つの素過程((1)二本鎖DNAの一本鎖への加工,(2)SSBで覆われた単鎖DNAの除去)を試験管内に再構成した.本年度はさらにすべての蛋白質群を一同に試験管内に混合し,相同組換え反応全体の再構成を試みた.モデル系として,プラスミドDNAを使用し,組換えられる方を直鎖状二本鎖DNA,組換えられるDNAに配列を提供するテンプレートとして環状二本鎖DNAを用意した.昨年度までに,RecJ, SSBにより直鎖状二本鎖DNAの末端が3端突出単鎖DNAに加工されることを確認しているので,この系にさらに3端突出単鎖DNA領域を相同な二本鎖DNAに対合させる活性を持つRecA,また,SSBで覆われた単鎖DNA領域をRecAに受け渡す役割を持つRecF, RecO, RecRを加えることにより,その試験管内での生成物を解析した.その結果,直鎖状二本鎖DNAの両3端突出単鎖DNA領域がそれぞれ環状二本鎖DNAの相同領域に対合した,三量体プラスミドDNAの生成が確認できた.このことは,試験管内に用意した二対のDNA間の間で相同組換えが生じたことを示している.以上のように,本研究課題の遂行により,人工的な新規遺伝子を生じさせる基盤技術を構築することに成功した.
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