2011 Fiscal Year Annual Research Report
化学合成DNAセンサーを用いたDNA修復の検出および解析
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21310142
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
岩井 成憲 大阪大学, 基礎工学研究科, 教授 (10168544)
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| Keywords | DNA損傷 / DNA修復 / オリゴヌクレオチド / 蛍光プローブ |
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| Research Abstract |
DNA修復の研究には^<32>Pで標識した基質が用いられ、酵素反応はゲル電気泳動により生成物を分離してその放射線を検出・定量することにより解析されてきたが、操作が面倒である上に放射性同位元素の使用における規制や危険性もあるため、修復反応の蛍光による検出法の開発を試みた。昨年度の研究で蛍光色素のリンカーと隣のヌクレオシドの間のリン酸ジエステル(PO)が細胞中で加水分解を受けることが明らかになったため蛍光プローブではこの部分をフォスフォロチオエート(PS)にする必要があったが、これを蛍光プローブの細胞への導入を確認するために利用できるのではないかと考え実験を行った。すなわち、酸化損傷を有するフルオレセインを蛍光色素として持つPSのプローブ1、損傷がなくフルオレセインを蛍光色素として持つPSのプローブ2、損傷がなくCy5を蛍光色素として持つPOのプローブ3を合成し、プローブ1と3あるいはプローブ2と3を混合してHeLa細胞にトランスフェクトした。その結果、前者では細胞の核においてフルオレセインとCy5の蛍光が、後者ではCy5のみが検出された。このことは、蛍光プローブの細胞への導入をCy5で確認した上で細胞中の塩基除去酵素の反応をフルオレセインで解析できることを意味し、特に細胞で酵素反応が起こらないことを示すために重要である。ヌクレオチド除去修復においては、この系の最短の基質の探索を続けた。昨年度は損傷の5'側についてDNAをどこまで縮めることができるかを調べたが、今年度は3'側について同様の実験を行った。100～140塩基対の基質の調製は問題なく行えたが、鎖切断が起こるはずの140塩基対の基質を細胞抽出液と反応させても断片が検出されなかった。これは、細胞抽出液が保存中に失活したことが原因と考えられ、今後あらためて抽出液の再調製や条件検討が必要である。
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Research Products
(2 results)
