2012 Fiscal Year Annual Research Report
構造情報と機能・配列相関の統合による酵素機能の改変
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21350096
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
宮本 憲二 慶應義塾大学, 理工学部, 准教授 (60360111)
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| Project Period (FY) |
2009-04-01 – 2013-03-31
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| Keywords | アリールマロン酸脱炭酸酵素 / 活性向上 / 機能改変 / ラセマーゼ |
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| Research Abstract |
脱炭酸反応のメカニズムを明らかとし、疎水性のポケットと基質の相互作用により脱炭酸反応がトリガーされることがわかった。この様なメカニズムを持つ酵素は今まで報告が無く、新たな知見である。
前年度に取得したフェニルメチルマロン酸に対して高い脱炭酸活性を示す４重変異体(G74C/V156I/M159L/C188G)に対して、2カ所同時変異を導入した。具体的には、疎水性ポケットを構成するVal43と、疎水性ポケットでは無いがVal43の近傍に存在するAla125に対して、2カ所に対して同時に変異を導入した。そして、高速スクリーニングを行ったところ、活性が数倍向上した変異体の取得に成功した。シークエンスにより配列確認を行ったところ、V43M/G74C/A125P/V156L/M159L/C188Gであることがわかった。現在、酵素学的諸性質の解析を行っており、まとまり次第論文発表を行う予定である。
ラセマーゼの機能改変のためには、ハイスループットなスクリーニング系が必要不可欠である。そこで、マンデル酸と錯体を形成すると蛍光を発するようなビナフトール誘導体を用いて、ラセミ化を迅速にアッセイする手法を検討した。その結果、R体のマンデル酸の錯体は、S体よりも蛍光強度が２倍以上強いことがわかり、光学純度の変化を検出可能であることがわかった。今後、この系を用いて活性向上のスクリーニングを実施する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Reason
24年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
24年度が最終年度であるため、記入しない。
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