2012 Fiscal Year Annual Research Report
イネプロラミンの翻訳及び小胞体内への集積機構の解明
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21380008
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
熊丸 敏博 九州大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (00284555)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
川越 靖 独立行政法人農業生物資源研究所, 植物科学研究領域, 主任研究員 (50355757)
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| Project Period (FY) |
2009-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | 貯蔵タンパク質 / 小胞体 / 分子シャペロン / 突然変異 / イネ |
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| Research Abstract |
① プロラミンmRNAの特定小胞体への局在に関与するたんぱく質の機能解析（熊丸、福田）プロラミンmRNAの特定小胞体への局在の関与が期待されるタンパク質Tuder-SN、RBP-P、RBP-Iに関して、それぞれ34系統、3系統、16系統について各変異ホモ個体を獲得した。
② イネプロラミン分子の翻訳時における合成制御機構の解明(小川、福田) ルシフェラーゼ遺伝子の終止コドンをTAA、TTG、TGAに置換した3種類の遺伝子コンストラクトを用いて、野生型品種及びesp1/eRF1変異体をそれぞれ形質転換した。これまでに、葉におけるルシフェラーゼ遺伝子の発現をリアルタイムPCRによって解析した結果、終止コドンTAAとTGAを有するルシフェラーゼによって形質転換したesp1変異体では、野生型形質転換体に比べ発現量がそれぞれ10%と60%まで減少した。一方、終止コドンがTGAのルシフェラーゼ遺伝子では発現量が野生型の95%とほとんど差は認められなかった。
③ CysRプロラミンの集積におけるPDI2-3の機能解明 (川越) GFP-PDIL2-3融合蛋白質を発現する組換えイネの登熟種子を材料にして、抗GFP抗体を用いた免疫沈降実験でシャペロン蛋白質のBiPが共沈することを明らかにした。PDIL2-3とBiPは小胞体内腔で共にPB-Iの表面に局在することから、両蛋白質の複合体形成がPB-I形成に関与することが示唆された。
④ esp3遺伝子の連鎖地図構築（熊丸） esp3変異の原因遺伝子の同定のために、esp3変異体と野生型との交雑F2個体を栽培し、esp3遺伝子をホモに持つ個体を選抜した。esp3個体別の葉よりDNAを抽出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
①プロラミンmRNAの特定小胞体への局在に関与するたんぱく質の機能解析. プロラミンmRNAの特定小胞体への局在の関与が期待されるタンパク質について、突然変異遺伝子の固定化を進めることができた。これら変異体の解析が期待される。
②イネプロラミン分子の翻訳時における合成制御機構の解明. 終止コドンを変換したルシフェラーゼ遺伝子の形質転換体を作出し、一部の組み換え体の葉において発現解析を行うことができた。今後、登熟種子を用いた解析が可能となることが期待される。
③CysRプロラミンの集積におけるPDI2-3の機能解明. これまで、PB-Iの形成にPDI2-3の関与を示す報告はないことから、新規の知見が得られた。
④esp3遺伝子の連鎖地図構築. esp3遺伝子をホモ個体よりDNAを得ることができたことから、今後の次世代シークエンサーによる解析が可能となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
①プロラミンmRNAの特定小胞体への局在に関与するたんぱく質の機能解析. 得られた変異体について、貯蔵タンパク質組成、共焦点レーザー顕微鏡、電子顕微鏡によってプロテインボディを解析する。
②イネプロラミン分子の翻訳時における合成制御機構の解明. 得られた組み換え体について、葉及び登熟種子におけるルシフェラーゼ遺伝子の発現と同タンパク質の活性を解析する。
③CysRプロラミンの集積におけるPDI2-3の機能解明. PDIL2-3のA360を含むチオレドキシン(Trx)ドメインのX線結晶構造解析によって野生型とA360T変異型を比較し、蛋白質立体構造と機能の相関を解析する。さらに、野生型又はA360T変異型蛋白質とGFPの融合蛋白質を発現する登熟種子を材料にして、抗GFP抗体を用いた免疫沈降実験を行い、共沈する蛋白質を比較解析する。
④esp3遺伝子の連鎖地図構築. 各個体のDNAを等量ずつ混合し（バルクDNA）、野生型DNAとバルクＤＮＡを次世代シークエンサーにより全塩基配列を解析し、得られたSNPを用いてesp3遺伝子の連鎖地図を構築する。
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Research Products
(13 results)
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[Journal Article] A guanine nucleotide exchange factor for Rab5 proteins is essential for intracellular transport of the proglutelin from the Golgi apparatus to the protein storage vacuole in rice endosperm2013
Author(s)
Fukuda M., Wen L., Satoh-Cruz M., Kawagoe Y., Nagamura Y., Okita T. W., Washida H., Sugino A., Ishino S., Ishino Y., Ogawa M., Sunada M., Ueda T., Kumamaru T.
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Journal Title
Plant Physiology
Volume: 162(2)
Pages: 663-674
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] GLUP6/GEF is the activator for GLUP4/Rab5a, and involved in intracellular transporting of proglutelin from Golgi to protein storage vacuole in rice endosperm2012
Author(s)
FukudaM., L. Wen, M. Satoh-Cruz, Y. Kawagoe, T. W. Okita, M. Ogawa, M. Sunada, T. Ueda, T. Kumamaru
Organizer
Plant Biology 2012
Place of Presentation
Austin, USA
Year and Date
20120719-20120721
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[Book] RNA Binding Proteins2012
Author(s)
Doroshenk K. A.., A. J. Crofts, H. Washida, M. Satoh-Cruz, N. Crofts, Y. Yang, R. T. Morris, T. W. Okita, M. Fukuda, T. Kumamaru, H. Satoh
Total Pages
18
Publisher
Landes Bioscience
