2009 Fiscal Year Annual Research Report
トランスポーター病に関与する蛋白質間相互作用の網羅的検出による分子病態の解明
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21380191
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
佐藤 耕太 Hokkaido University, 大学院・獣医学研究科, 准教授 (50283974)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
稲葉 睦 北海道大学, 大学院・獣医学研究科, 教授 (00183179)
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| Keywords | トランスポーター / チャネル / 蛋白質間相互作用 / 生体膜 / RNAi |
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| Research Abstract |
本研究では、膜トランスポーター分子の蛋白質間相互作用を網羅的に検出する手法およびその検証モデルを確立するために、いくつかの膜蛋白質の恒常的発現細胞系を確立する一方、shRNAライブラリーの作製を試みた。まず、モデル蛋白質として赤血球膜anion exchanger 1(AE1 ; band 3)およびGLAST型グルタミン酸トランスポーター発現細胞株を樹立した。これらの分子は両者ともに、赤芽球系細胞K562あるいは人腎由来HEK293細胞において主に細胞膜に局在する一方、細胞内エンドソームにも分布し、表面ビオチン化法による解析から細胞内～細胞膜表面をリサイクリングしていることが明らかとなった。このリサイクリングの過程はsmall GTPaseの一種であるARF6の機能を阻害することにより、抑制されることから、これらの分子間相互作用がAE1やGLASTなどのいくつかの膜蛋白質の膜小胞輸送に重要な役割を果たしていることが示唆された。一方、shRNAライブラリーについては、上記膜蛋白質分子特異的なshRNAは抑制効果を示したものの、HEK293細胞cDNA由来制限酵素消化断片を用いたshRNAレンチウイルスライブラリーを上記恒常的発現細胞株に適用した場合、明らかな抑制は見られなかった。原因として、cDNAを材料とした場合に十分なcomplexityは得られなかったことが考えられることから、現在、合成オリゴを用いたライブラリーの作製を試み、引き続き網羅的ネガティブセレクションに使用可能なshRNAライブラリーの確立を実施している。
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