安定型マトリックスメタロプロテナーゼ3を用いた新しい歯髄炎治療薬の開発

2009 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21390512
• Research Institution: Aichi Gakuin University
• Principal Investigator: 中村 洋 Aichi Gakuin University, 歯学部, 教授 (40064878)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中島 美砂子 国立長寿医療センター(研究所), 口腔疾患研究部, 室長 (20207773) ; 中田 和彦 愛知学院大学, 歯学部, 講師 (70261013) ; 江口 傑徳 国立長寿医療センター(研究所), 口腔疾患研究部, 室長 (20457229)
• Keywords: 歯髄炎治療薬 / 覆髄剤 / MMP3 / 歯髄再生 / 歯髄炎治療

Research Abstract

ヒトMMP3は発現しても短時間で分解されるが、ウサギMMP3は持続性・安定性に優れている。アミノ酸レベルでヒトとウサギでは80%以上保存されているが、触媒ポケット近傍5アミノ酸が異なっており、これがヒトとウサギにおけるMMP3の安定性の違いに起因すると考えられている。そこで、ヒトproMMP3のアミノ酸配列の一部をウサギproMMP3のアミノ酸配列に変換し、タンパク質発現実験により安定した改変型ヒトproMMP3を得ることを目的とした。
ヒトproMMP3プラスミド(天然型)の活性ドメインのアミノ酸の一部を、ウサギのもの(N末側から172番目XaaをIleで、239番目XaaをValで、241～243番目Xaa-Xaa-XaaをAsn-Ala-Phe)に改変するためKOD Mutagenesis Kitを使用し、Inverse PCR法により安定したウサギ改変型ヒトproMMP3プラスミドを得た。得られた改変型プラスミドを大腸菌に取り込み、タンパク質発現させ、CelLytic B Plus kitを用いタンパク質を抽出した。使用したプラスミドにはFLAG tagの遺伝子も組み込まれており、FLAG[!○R] M Purification kit(Sigma)を用いて、免疫沈降およびSDS-PAGEによりproMMP3の発現を確認した。抽出したタンパク質を免疫沈降法により精製し、SDS-PAGEの後CBB染色により57kDaおよび59kDaのバンドを認めた。これがヒトproMMP3の分子量と一致することから、抽出したタンパク質に改変型ヒトproMMP3タンパク質が含まれていることを確認した。改変型は天然型に比べ、比活性が高いことが明らかとなった。現在、この改変型の、天然型との安定性の比較を行なっている。