2010 Fiscal Year Annual Research Report
分子内サブドメイン間相互作用によるリアノジン受容体チャネル制御機構の解明
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21500383
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
村山 尚 順天堂大学, 医学部, 准教授 (10230012)
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| Keywords | リアノジン受容体 / カルシウムチャネル / 筋小胞体 / 悪性高熱 |
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| Research Abstract |
リアノジン受容体(RyR)は骨格筋および心筋の細胞内Ca2+遊離チャネルで、その遺伝子突然変異は種々の疾患を引き起こす。疾患変異を有するRyRではチャネル活性の異常亢進が見られることから、疾患変異がRyR分子内の特定のサブドメイン間相互作用を破綻させ、その結果チャネル活性が異常亢進している可能性がある。本研究では、RyR分子内サブドメイン間相互作用の実体とその制御機構を解明するため、野生型および疾患変異型のRyRサブドメインを種々のプローブ(ナノゴールド、分子内架橋、FRET)で特異的に標識して解析をおこない、サブドメイン間相互作用をアミノ酸残基レベルで解明することを目的とした。21年度の成果において1型リアノジン受容体(RyR1)の2つのサブドメイン(SD1/SD2)のうち、SD1のドメインマッピングに成功したので、22年度はSD2のドメインマッピングを引き続き行うとともに、SD1にFRETイメージング用の蛍光プローブの導入を行った。
SD2のドメインマッピングについては、プローブ挿入部位を近傍のアミノ酸配列に広げてHis-tagを挿入した変異体を作製した。これにNi-NTA金粒子を結合させ、電子顕微鏡観察を行ったところ、SD2のC末側100アミノ酸程度のドメインの位置のマッピングに成功した。FRETイメージング用の蛍光プローブはGFPをドナーとしてCy3をアクセプターとして用いることとした。そのためにCy3-NTAを合成し、His-tagへの結合を行った。モデルタンパク質としてGFPを用いた実験では、Cy3-NTAの特異的な結合が観察された。精製したRyR1タンパク質を用いた実験で、SD1についてはHis-tagを挿入した変異体に対して特異的にCy3-NTAが導入されたことが確かめられた。SD2については、現在も検討を続けている。
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Research Products
(3 results)
