バキュロウイルス時間差多重感染による糖鎖修飾ライブラリー構築システムの開発

2009 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21510220
• Research Institution: Akita University
• Principal Investigator: 後藤 猛 Akita University, 工学資源学部, 准教授 (10215494)
• Keywords: 糖鎖化学 / 糖鎖修飾 / 糖転移酵素

Research Abstract

生理活性発現に重要な働きをしている糖タンパク質の機能発現メカニズムを解明には糖鎖ライブラリーの活用が非常に効果的と考えられる。本研究では,種々の糖転移酵素遺伝子をそれぞれ導入した複数のバキュロウイルスを時間差で多重感染させる感染培養戦略によって,糖転移酵素の種類と濃度を時系列的に変化させる糖鎖修飾システムを昆虫細胞培養系内に形成させ,様々に糖鎖修飾したタンパク質の生産を可能にする組換えタンパク質糖鎖修飾ライブラリー構築の開発を目的としている。
糖転移酵素β-1,4-galactosyltransferase (Gal-T)の膜アンカー部位を除去したcDNAを感染前期にはたらくGP64プロモーターリ(P_<gp64>)の下流に導入してトランスフェクションベククーpFastBac-P_<gp64>-GalTを作成した。さらに,Bac to Bacシステムを利用したバクミドとの部位特異的トランスポジションによって高タイターのGal-T発現バキュロウイルスAcGalTを構築した。さらに,このAcGalTをSf-9昆虫細胞に感染させ,放射性基質を用いたアッセイによってGal-Tの発現挙動を調べた。同様に,N-acetylglucosamine transferase (GlcNAcT)および修飾対象モデルタンパク質であるヒトインクーロイキン(hIL-2)のcDNAを導入したトランスフェクションベクターpFastBac-P_<gp64>-GlcNAcTおよびpFastBac-P_<gp64>-hIL2をそれぞれ作成した。