2009 Fiscal Year Annual Research Report
大腸菌におけるジアシルグリセロールの生理的意義の解明
| Project/Area Number |
21570110
|
|---|
| Research Institution | Iwate University |
|---|
Principal Investigator |
西山 賢一 Iwate University, 農学部, 教授 (80291334)
|
|---|
| Keywords | 大腸菌 / ジアシルグリセロール / タンパク質膜挿入 / 自発的膜挿入 / MPIase / 機能的膜タンパク質合成 / 再構成 / SecG |
|---|
| Research Abstract |
大腸菌において、膜内在性タンパク質はいくつかの経路を経て膜挿入することが知られている。その中で、シグナル認識粒子(SRP)や膜透過装置(Sec因子)に依存しない経路は、リン脂質のみからなるリポソームにも膜挿入することから、自発的に膜挿入すると考えられてきた。しかし、申請者らはこの自発的膜挿入反応は、リポソームに生理的濃度のジアシルグリセロール(DAG)が欠如するために起こること、実際の膜挿入は新奇複合糖脂質MPIaseに依存して起こることをin vitro実験系を用いて証明した。DAGは実際にin vivoでも自発的膜挿入の抑制に関与することを証明するため、DAG枯渇株を構築し、その株における膜挿入反応を解析することを試みている。大腸菌におけるDAG生合成経路は不明な点が多く、数種の遺伝子の関与が示唆されているのみであった。これらの遺伝子の多重変異、および大量発現株を構築したが、DAGの発現レベルは全く変化しなかった。そこで、大腸菌の遺伝子配列を検索し、フォスファターゼ等DAGの生合成に関与する可能性のある遺伝子を20種あまりをターゲットとして、多重変異株を構築している。しかし、上記遺伝子に加えていくつかの遺伝子破壊を行っても、菌の生育およびDAGの発現レベルには全く変化は認められなかった。DAGの発現は多くの遺伝子により厳密に制御されていることが強く示唆された。現在も多重変異株を構築している。
一方、膜挿入に必須の因子MPIaseはTLC上、SDS-PAGE上で単一な成分として、構造決定に必要な量を得ることに成功した。この精製因子を用いて構造解析に供したところ、3糖による繰り返し配列を持ち、末端のDAG構造とピロリン酸で結合していることが明らかとなった。また、繰り返し糖部分には多くのN-アセチル基(単位当たり3-4個)を持つことが判明した。この精製因子は高い挿入活性を持ち、野生株から調製した膜小胞に匹敵する活性が検出された。さらには、機能的膜タンパク質のin vitro合成系も確立された。
|
Research Products
(5 results)
