2009 Fiscal Year Annual Research Report
リベロマイシン誘導体創製に向けた新規生合成酵素群の反応機構解明
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21580104
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| Research Institution | The Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
高橋 俊二 The Institute of Physical and Chemical Research, 化学情報・化合物創製チーム, 専任研究員 (30311608)
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| Keywords | リベロマイシンA / ポリケチド / 放線菌 |
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| Research Abstract |
以下の3項目の研究を実施した。
1.遺伝子破壊と中間代謝産物の解析:リベロマイシン生産菌(Streptomyces reveromyceticus)から同定したリベロマイシン生合成遺伝子クラスターに見出される機能未知遺伝子を効率的に解析するために、λRedシステムを導入し、全遺伝子の破壊ベクターを調製した。各破壊ベクターを用い、P450RME、revL、revXの遺伝子破壊を行った。P450RME遺伝子破壊株に蓄積する代謝産物の解析を行った結果、生合成中間体としてRM-Eを同定した。revL遺伝子破壊株では、リベロマイシン類の生産が半減したが、新規代謝産物は同定されなかった。revX遺伝子破壊株に蓄積する代謝産物について、現在構造解析を進めている。RevSと予想される遺伝子の破壊は、現在進行中である。
2.生化学的解析:フラビン依存酸化酵素RevX機能解明に向けて、異種発現により蛋白質精製を試みた。大腸菌での発現が困難であった為、放線菌Streptomyces lividansを用いた発現系の構築を行った。RevLは、脂肪酸-ポリケチドハイブリット形成に必要な鍵酵素と推定し、大腸菌発現蛋白質を調製し、各種脂肪酸基質との反応を解析したところ、RevLの機能は、脂肪酸-CoAリガーゼであることが判明した。
3.X線結晶解析情報を基にした新規酵素反応の創出
P450RME-リベロマイシンEの共結晶解析データを利用して、部位特異的変異導入を行った。変異導入した蛋白質を発現、精製し反応産物の解析を行ったところ、水酸化部位改変が可能となるアミノ酸残基を見出す事が出来た。
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