2010 Fiscal Year Annual Research Report
リベロマイシン誘導体創製に向けた新規生合成酵素群の反応機構解明
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21580104
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| Research Institution | The Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
高橋 俊二 独立行政法人理化学研究所, 化学情報・化合物創製チーム, 専任研究員 (30311608)
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| Keywords | リベロマイシンA / ポリケチド / 放線菌 / 生合成 |
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| Research Abstract |
以下の3項目の研究を実施した。
1.遺伝子破壊と中間代謝産物の解析:放線菌(Streptomyces reveromyceticus)から同定したリベロマイシン生合成遺伝子クラスター中の未知遺伝子を解析するために、λRedシステムを用いて21個の遺伝子破壊ベクターを調製し、各遺伝子破壊株の構築と蓄積する代謝産物の解析を行った。新たに注目したRevG遺伝子破壊株から、ポリケチド合成酵素により生成すると考えられるRM-A1aが蓄積することを見出した。ポリケチド鎖修飾以前の生合成鍵中間体と考えられることから、RM-A1aを起点とした生合成解析が重要である事が示唆された。さらに、各種の遺伝子破壊株を解析した結果、不安定中間体を経由する生合成ステップが見出されたことから、遺伝子破壊株の解析に加えて、生化学的解析が生合成機構の解明に必須である事が予想された。
2.生化学的解析:フラビン(FAD)依存酸化酵素機能解明に向けて、大腸菌を用いた異種発現系を詳細に検討したところ、発現が困難であったFAD依存酵素の可溶化と精製酵素の調製に成功した。さらに、遺伝子破壊株を用い隔た生理的基質の調製を進め、反応機構を解析する基盤を構築した。脂肪酸-ポリケチドハイブリット形成に必要な鍵酵素について、酵素化学的性質を詳細に検討し、不飽和脂肪酸特異的に反応を行うことが出来る脂肪酸-CoAリガーゼ機能を明らかにした。
3.X線結晶解析情報を基にした新規酵素反応の創出
P450-リベロマイシンEの共結晶解析データを利用して、新規誘導体創製に向けた部位特異変異導入を進めた。また、脂肪酸-CoAリガーゼの精製条件及び結晶化条件の検討を進めた。
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