2011 Fiscal Year Annual Research Report
ホモKOブタ個体作成のためのdouble KO細胞の標準的取得法の開発
| Project/Area Number |
21580350
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
佐藤 正宏 鹿児島大学, フロンティアサイエンス研究推進センター, 教授 (30287099)
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| Keywords | KOブタ / ホモ / gene targeting / 薬剤耐性 / 体細胞核移植 / 胎仔性繊維芽細胞 / 遺伝子導入 / double KO |
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| Research Abstract |
特定の遺伝子機能が破壊されたいわゆるKOブタ個体を作成するには、マウスの場合と異なり、in vitroでのホモKO体細胞の作成、その体細胞核移植という経路を辿る。ブタの場合、ホモKO細胞の作成は、その後の実験のスピードを左右する重要な問題である。ヘテロKO細胞由来の個体に比べ、2年ほど実験時間が短縮されるからである。ホモKO体細胞の作成に至る種々の条件(薬剤耐性性等)が不明故、基本的な問題を検討した。その結果、ミニブタ胎仔性繊維芽細胞(PEF)は、blasticydine S, hygromycin B, zeocin等の様々な薬剤に感受性があった(Sato et al., in press)。なお、予備的な検討では、puromycin等の薬剤では、濃度を高めることで、組換え細胞の死滅が誘導された。
通常のKOシステムでは、内在性の標的遺伝子を破壊するために、いわゆるgene targeting (GT) vectorの構築が必要となる。今回細胞表面糖鎖であるα-Galepitopeを合成する酵素α-1,3-GalTをコードする遺伝子を標的とした。GT vectorとしてpuromycin耐性遺伝子(puro)を有するvector pPGalTを構築した。これを腎臓上皮由来細胞に遺伝子導入した(以前は、PEFをドナー細胞に用いていたが、重複の遺伝子導入には耐えられず、不適と判断)。得られたヘテロKO細胞に更にpPGalTを導入し、細胞を高濃度のpuromycinで選別することで、ホモKO細胞を得た(論文作成中)。この場合、ホモKO細胞は、α-Galepitopeを無くすので、それを識別するBS-I-B4レクチンに毒素(saporin)を結合させたIB4-SAPで遺伝子導入後の細胞を処理すると、簡単にホモKO細胞を濃縮出来る。後は、体細胞核移植経由でブタ個体を作成するのみであるが、与えられた補助金の期限内ではまだ時間が足らなかった。現在、更なる実験を継続中である。
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[Journal Article] Innate immune system still works at diapause, a physiological state of dormancy in insects2011
Author(s)
Nakamura A, Takezawa Y, Ohnami N, Sato M, Ono C, Harada Y, Yoshida K, Kawano N, Kanai S, Miyado M, Umezawa A
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Journal Title
Biochemical and Biophysical Research Communication
Volume: 410
Pages: 351-357
Peer Reviewed
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[Journal Article] Beta-catenin is a molecular switch that regulates transition of cell-cell adhesion to fusion2011
Author(s)
Takezawa Y, Yoshida K, Miyado K, Sato M, Nakamura A, Kawano N, Sakakibara K, Kondo T, Harada Y, Ohnami N, Kanai S, Miyado M, Saito H, Takahashi Y, Akutsu H, Umezawa A
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Journal Title
Scientific Reports
Volume: 1
Pages: 68
Peer Reviewed
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