| Research Abstract |
難治性病態における急性期蛋白糖鎖応答のダイナミズムの解明と糖鎖機能改変モデルの構築を目的に,急性期糖蛋白のモデルとして動物α1酸性糖蛋白(AGP)について,本年度は,(1)臨床応用を目的にウシおよびネコのAGPのcDNAクローニングおよび実験動物モデルとしてマウスAGPのcDNAクローニング,(2)AGPのin vitro蛋白発現,(3)AGPに対するモノクローナル抗体の作製を実施した.
(1) AGP cDNAクローニング
(1) ウシ(黒毛和種)の肝細胞からtotal RNAを抽出し,RT-PCR法により遺伝子増幅を行った後,TAクローニングを実施した.その結果,ウシAGP遺伝子のcDNAを得ることができた.ウシAGP遺伝子は,翻訳領域は609塩基からなり,一部に品種の違いと考えられる変異が認められたが,既知のデータとほぼ一致しており,5つのN-glycosylation siteを有していた.
(2) ネコ(雑種)では肝細胞からは目的の増幅産物は得られなかった.そこで,ネコゲノム遺伝子配列データベースを基に,cDNAを作製した.予想された全翻訳領域は603塩基でウシ同様5つのN-glycosylation siteを有していた.
(3) マウス(ICR系)では,50ugを腹腔内投与した後,肝細胞からRNAを抽出し,RT-PCR法により遺伝子増幅を行った後,TAクローニングを実施した.その結果,マウスAGP遺伝子のcDNAを得ることができた.マウスAGP遺伝子の全翻訳領域は621塩基であり,部分的に系統差と考えられる変異がみられたが,Balb/cとほぼ一致していた.また,5つのN-glycosylation siteを有していた。これを用いてin vitroでの蛋白発現を試みた.
(2) AGPのin vitro発現
マウスAGP cDNAについて大腸菌での蛋白発現を試みた.その結果,可溶性画分に約37kDaの蛋白が観察され,目的のチオレドキシンとの融合蛋白であると推定された.これらの蛋白を精製し,Enterokinaseによる切断とtag蛋白の除去を行ってさらに精製したところ,マウスAGPと考えられる約22kDaの蛋白バンドが得られた.現在,ウシおよびネコについても大腸菌発現および哺乳動物細胞発現を試みている.
(3) モノクローナル抗体の作製
精製されたマウスAGPを用いて常法によりモノクローナル抗体の作製を試みた.免疫にはラットを用い,フットパッドに注射し,膝下リンパ節を回収して細胞融合を行った.その結果,培養プレート83穴全てのウェルで融合細胞が観察され,83穴中74穴が抗体陽性であり,本法は融合効率,抗体陽性率の高い方法であると推測された.現在クローニング中である.
その他,難治性疾患(リーシュマニア症・レプトスピラ症など)における疫学・病態に関する基礎的知見も得られている.
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