2011 Fiscal Year Annual Research Report
異性化タンパク質修復酵素PIMTの活性調節機構の解析
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21590069
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
古地 壯光 北里大学, 薬学部, 准教授 (00302167)
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| Keywords | アスパラギン酸 / アスパラギン / PIMT / 異性化 / ラセミ化 / タンパク質 / 修復 / 発現調節 |
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| Research Abstract |
タンパク質中のL-アスパラギン残基(L-Asp)及びL-アスパラギン酸残基は、タンパク質の老化の過程で、生理的条件下で自発的に異性化またはラセミ化し、D-アスパラギン酸残基(D-Asp)やイソアスパラギン酸残基(D,L-isoAsp)へと変換されることが知られている。一方、生体内にはD-AspやL-isoAspをL-Aspへと戻す反応を促進する酵素であるProteinL-isoaspartyl(D-aspartyl) methyltransferase(PIMT)が存在する。しかし、その生理学的機能は未だ不明な点が多い。本研究では、PIMTの生理学的機能を明らかにすることを目的とし、そのプロモーター領域の解析を行い、プロモーター活性に必須な領域(27bp)を決定、また、本領域に結合活性を有する転写活性化因子の候補として、Nuclear respiratory factor 1(NRF1)の同定に成功している。一方、そのプロモーター活性に必要な最小領域の解析から、NRF1だけでなく他の因子も必要であることが示唆されている。そこで次に本研究では、プロモーター活性に必須なNRF1以外の因子の同定を試みた。まずゲルシフトアッセイを用いて、in vitroにて転写活性化必須領域にNRF1以外の何らかの因子が結合する条件を模索し、決定した条件を用いて結合因子を精製し、LC-MS/MSにて同定を試みた。その結果、Transcription factor A, mitochondrial(TFAM)が検出された。TFAMはNRF1により発現制御される転写因子の1つであり興味深い。今後は、TFAM siRNA発現プラスミドを構築し、細胞に導入後、PIMTの発現をRT-PCR法等により確認し、細胞レベルで実際にTFAMがPIMTの発現制御に関与しているか確認を行っている。
一方、レポーター遺伝子を用いてPIMTの発現に影響を及ぼす薬剤の探索を行ったところ、脱共役剤であるCCCPがPIMTのプロモーター活性を上昇させることを見いだした。しかしながら、western blottingによるタンパク質レベルでの解析では影響が認められなかったため、この点に関しては今後の検討課題である。
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