劇症1型糖尿病と自己免疫性膵炎に認められる膵特異的自己抗体の意義と臨床応用

2009 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21591127
• Research Institution: University of Yamanashi
• Principal Investigator: 遠藤 登代志 山梨大学, 大学院・医学工学総合研究部, 准教授 (00152017)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小林 哲郎 山梨大学, 大学院・医学工学総合研究部, 教授 (30113442) ; 金重 勝博 山梨大学, 医学部附属病院, 助教 (20377518) ; 滝澤 壮一 山梨大学, 医学部附属病院, 医員 (80456467)
• Keywords: 劇症1型糖尿病 / 自己免疫性膵炎 / 自己抗体 / アミラーゼ / ELISA

Research Abstract

申請者らは膵アミラーゼ抗体は劇症1型糖尿病と自己免疫性膵炎に共通した膵特異的自己抗体であることをみいだしたが、今回本自己抗体測定のための高感度測定系を樹立し、両疾患の早期診断・臨床経過における有用性を検討する目的にて、以前開発したELISA測定系の改良を試み、更に両疾患の患者血清の収集とリストの作成に努めた。
ELSAの改良は、1プレートの選定、2バックグランド低減のためのcoating buffer,blocking buffer、washing bufferの検討、3抗原の量および純度に関する3項目を中心に行った。
その結果、プレートに関しては、現在の高結合タイプが陽性/陰性の識別能が高く、バックグランド低減のためには、0.1M carbonate bufferが優れ、blockingには1% BSAが最適であることが判明した。またwashing bufferは現行の0.05% Twen20を含むTris bufferで良好であった。最も結果を左右したのは、抗原であるヒトリコンビナントアミラーゼA2の溶解性に関するものであった。この抗原は大腸菌内でinclusion body中に蓄積され、その溶出に6M Ureaを用いるが、これを透析にて除去する過程にて不溶化しやすく、また、長時間の操作で分解されることも判明した。現在、精製抗原は-80℃で保存し、使用直前に溶解・coatingを行っている。
一方、これらの改良にも関わらず、低力価抗体の検出はELISA readerの性能に限界があり、装置の更新の必要があり、患者血清のデータはこれを待って行わざる得ないと判断された。