糸球体上皮細胞のAMPK-ACC経路制御による糖尿病性腎症に対する新たな治療戦略

2009 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21591130
• Research Institution: Shiga University of Medical Science
• Principal Investigator: 一色 啓二 Shiga University of Medical Science, 医学部, 助教 (60378487)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 前田 士郎 独立行政法人理化学研究所, ゲノム医科学研究センター・内分泌代謝疾患研究チーム, チームリーダー (50314159)
• Keywords: 糖尿病 / 脂質 / 脂質代謝異常 / 糖尿病性腎症

Research Abstract

新規糖尿病性腎症関連分子acetyl-CoA carboxylaseβ(ACCβ)の糖尿病性腎症進展の関与とその活性抑制を標的とした糖尿病性腎症に対する新たな治療戦略の可能性を検討するため、平成21年度は、ACCβ過剰発現が及ぼす糸球体上皮細胞の細胞数、機能への影響を検討した。まず遺伝子工学技術(アデノウイルス、トランスジェニックマウス)を用い培養細胞やマウス糸球体上皮細胞にACCβ発現増強を行い、病的状態(高脂肪食負荷等)で見られるようなACCβ発現状態を誘導した。
(A)ヒトacetyl-Coenzyme A carboxylase beta(Acacb)遺伝子をアデノウィルス作製用プラスミドに挿入、大腸菌で増殖させた後精製、Ela遺伝子持続発現HEK293細胞にトランスフェクションし、組換えアデノウィルスを作製した。作成したヒトAcacb組換えアデノウィルスを培養糸球体上皮細胞に感染させ、ACCβの過剰発現を確認した。糸球体上皮細胞に及ぼすSlit構成蛋白(ネフリン等)発現の変化などの形態学的異常、アポトーシス、および脂肪酸合成・分解酵素など機能蛋白発現・活性変化への影響を野生型培養糸球体上皮細胞と比較検討した。Acacb過剰発現糸球体上皮細胞を高糖濃度条件下に培養し、細胞形態学的異常、アポトーシス、脂肪酸合成・分解酵素など機能蛋白発現・活性変化への影響を、正常糖濃度条件下と比較検討している。
(B)糸球体上皮細胞の特異的蛋白であるネフリン蛋白のプロモーターを用い、ACCβを糸球体上皮細胞特異的に過剰発現するトランスジェニックコンストラクトを作製し、糸球体上皮細胞特異的なACCβ過剰発現トランスジェニックマウスを作成した。Genotyping陽性マウスから糸球体を単離、糸球体から採取したmRNAを用いた定量的RT-PCR法およびin situ hybridizationの組織学的手法を用いてACCβが糸球体上皮細胞に過剰発現していることを確認した。続いて組織特異的ACCβ過剰発現が腎局所の脂質代謝や腎機能に及ぼす影響を解析するために、体重推移や、血中脂質・血糖値など全身における代謝マーカーを測定、腎評価項目として尿中アルブミン定量やCcr、糸球体上皮細胞数や線維化、脂肪蓄積などの腎組織学的検討、腎抽出蛋白やmRNAを用いた腎局所の脂質代謝関連分子の発現量や活性を経時的に測定し、野生型マウスと比較評価を施行している。