タイムラプスイメージングによる破骨細胞の動態機能解析

2010 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21591940
• Research Institution: Hamamatsu University School of Medicine
• Principal Investigator: 星野 裕信 浜松医科大学, 医学部, 准教授 (70293636)
• Keywords: 破骨細胞 / 骨吸収 / ビデオマイクロスコピー / 顕微鏡 / アクチン

Research Abstract

破骨細胞の骨吸収過程における細胞内形態の動的変化、酸分泌機構を可視化するために、本年度は安定したアクチン染色による蛍光条件の確立と空胞様構造における形態変化の画像解析を行った。まず、アクチン染色による蛍光条件の確立のために培養顕微鏡としてNikon Biostation IMを用いてリン酸カルシウムコートカバースリップ上で破骨細胞を培養の上タイムラプス記録を行った。アクチン染色にはナノモルレベルでF-actinを蛍光染色できるAlexa Fluor 488 Phaloidinを用いた。波長励起(495nm)、一波長蛍光(520nm)の条件を設定し、染色時間と染色濃度の設定を行い、蛍光観察にてアクチンが観察できるようになった。しかし、染色と蛍光強度の再現性が安定せず、別の試薬での蛍光条件の確立を行うこととした。次に空胞様構造における形態変化の解析であるが、数多く観察でき破骨細胞の中から、多数の空胞様構造を有する特に吸収活性の高い破骨細胞をターゲットとし、細胞内におけるこれら空胞様構造のリアルタイム解析を行った。骨吸収活性が高まるにつれて細胞内においてその空胞様構造の分布に変化が現れ、特に大きな細胞に偏心性に偏って分布することが確認できた。この分布の変化は骨吸収活性の高まった破骨細胞に特有の変化であると思われる。今後はこの事実のより詳細な検証と、カルシトニンやより強力な骨吸収抑制剤であるビスフォスフォネートの存在下において調べるとともに、強力な骨形成を促すPTH製剤の存在下において、細胞内空胞様構造の変化を調べる予定である。