2009 Fiscal Year Annual Research Report
局所免疫寛容を誘導する同種再構築皮膚の開発に関する基礎研究
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21592290
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| Research Institution | Sapporo Medical University |
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Principal Investigator |
松本 佳隆 Sapporo Medical University, 医学部, 助教 (70452977)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
四ツ柳 高敏 札幌医科大学, 医学部, 教授 (70250595)
江副 京理 札幌医科大学, 医学部, 講師 (20274938)
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| Keywords | 同種皮膚移植 / 免疫寛容 / サイトカイン / 再構築皮膚 / 3次元培養 / 組織工学 / 不死化株 / HPV E7 |
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| Research Abstract |
再構築皮膚の同種移植動物モデルを作製することとした。再構築皮膚を作製するためには構成細胞として表皮部分を担う表皮細胞と真皮部分を担う線維芽細胞が最低限必要と考えられた。線維芽細胞は比較的簡単に分離培養が可能ではあるが、表皮細胞は分離培養が難しく、また、可能な継代数も通常5継代前後でありin vivoの実験を行うために必要な細胞数を確保するのも難しい現状がある。実験精度を上昇させるためにも表皮細胞の不死化株を作製することが有意義であると考えられた。ラットの細胞を不死化させる方法として、HPV16 E7の遺伝子導入(pRbの不活化目的)が報告されている。我々はまず、HPV16に感染の既往のある子宮頸癌の細胞株からmRNAを抽出しE7の特異的プライマーを用いてRT-PCRを行いE7のcDNAを作製し、これを遺伝子発現ベクター(pMXs-puro)に組み込んだ(pMXs-E7)。
同種移植実験にはヒトの同種移植と同程度の免疫を生じるACIラットとLEWラットの組を使用し、再構築皮膚作製のために表皮細胞および線維芽細胞の分離培養を計画した。ACIラットより皮膚を採取し、Dispase処理を行い表皮と真皮に分けた。真皮部分からは、真皮組織を細切後explant culture methodで線維芽細胞を培養した。線維芽細胞は通常培養液(10%FCS加DMEM)にて、順調に増殖しprimary cultureに成功した。表皮細胞は表皮部分からトリプシン処理し、培養液KGMを使用した方法で培養を開始したが、線維芽細胞の混入が多くこの方法を断念した。次に培養液CnT-3を使用した方法に切り替え培養したところ、順調に増殖しラット表皮細胞のprimary cultureに成功した。現在、表皮細胞・線維芽細胞へE7-cDNAを遺伝子導入し不死化するかどうか検討中である。
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