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2010 Fiscal Year Annual Research Report

停止複製フォーク結合タンパク質PriAを用いた染色体脆弱部位の探索

Research Project

Project/Area Number 21657036
Research InstitutionTokyo Metropolitan Organization for Medical Research

Principal Investigator

正井 久雄  (財)東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 参事研究員 (40229349)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 田中 卓  (財)東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 研究員 (80425686)
加納 豊  (財)東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 研究員 (90450593)
KeywordsPriAタンパク / 複製フォーク / 染色体脆弱部位 / 染色体免疫沈降 / aphidicolin / ChIP-chip解析 / DNA複製停止 / DNAヘリカーゼ
Research Abstract

本研究では、大腸菌PriAタンパク質の「停止した複製フォークに選択的に強く結合する」という生化学的性質をtoolとして、複製が停止しやすいあるいはslow downする染色体脆弱部位を染色体上の複製が停止し易い領域あるいは、停止した際に適切に回復さない領域として網羅的に探索することを計画した。
動物細胞(がん細胞あるいは正常細胞)でPriAタンパクを発現し、正常に複製している状態あるいは低濃度のaphidicolinあるいはHU(ヒドロキシ尿素:複製阻害剤)で複製進行を阻害した場合にPriAタンパク質が結合するDNAを染色体免疫沈降法で濃縮し、同定する。期間内に、このシステムを構築し、複製停止部位をゲノムワイドで同定する。種々のヒト細胞でtag付きPriAをectopicに発現する細胞株を樹立し、tagに対する抗体を用いた染色体免疫沈降法により、沈降されるDNAを濃縮、増幅し、ゲノムタイリングアレイへのhybridizationあるいは網羅的塩基配列決定により、複製フォークの停止し易い領域をゲノムワイドで同定する計画である。本年度の成果は以下の通りである。
1 作製したPriAに対する特異抗体および付加したtagに対する抗体により、様々な細胞(ヒトがん細胞および正常細胞)に発現したPriAを免疫沈降できることを確認した。また、クロスリンクによる染色体免疫沈降条件下でも解析可能な効率で免疫沈降できることを確認した。マイクロアレイ解析に持ち込める染色体を沈降させるための条件検討を重ね、最適条件を決定した。
2 まず大腸菌をもちいて、染色体免疫沈降を行い、マイクロアレイによる検出を試みた。コントロールとして、PriA欠損株のほか、複製起点や複製中のフォークに存在するDnaBなど、複製装置を構成するタンパク質を利用した。これらの大腸菌のゲノム上に検出される各ピークの解析において、既存のソフトウェアでは結合イベントの妥当性を正確に見積もれなかったため、専用のアルゴリズムを作製し、現在検証中である。

  • Research Products

    (25 results)

All 2011 2010

All Journal Article (18 results) (of which Peer Reviewed: 18 results) Presentation (4 results) Book (3 results)

  • [Journal Article] Pre-firing binding of Mrcl defines the early-firing origins which are selectively hyper-activated upon loss of fork stabilizing factors in fission yeast.2011

    • Author(s)
      Hayano, M., Kanoh, Y., Matsumoto, S., Kakusho, N., Masai, H.
    • Journal Title

      Mol.Cell.Biol.

      Volume: 31 In press

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Efficient expression and purification of human replication fork-stabilizing factor, Claspin, from mammalian cells : DNA binding activity and novel protein interactions.2011

    • Author(s)
      Uno, S, Masai, H.
    • Journal Title

      Genes to Cells

      Volume: 16 In press

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Molecular mechanism of activation of human Cdc7 kinase : Bipartite inter action with Dbf4/ASK stimulates ATP binding and substrate recognition.2011

    • Author(s)
      Ryo Kitamura, Rino Fukatsu, Naoko Kakusho, Yong-Soon Cho, Chika Taniyama, Satoshi Yamazaki, Gaik-theng Toh, Kazuo Yanagi, Naoko Arai, Ho-Jin Chang, Hisao Masai
    • Journal Title

      J.Biol.Chem.

      Volume: 286 In press

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] RecQL4 : a helicase linking formation and maintenance of a replication fork.2011

    • Author(s)
      Masai, H.
    • Journal Title

      J.Biochem.

      Volume: 142 In press

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Cdc7L1.2011

    • Author(s)
      Toh G-T., Masai, H.
    • Journal Title

      UCSD-Nature Molecule Pages

      Volume: In press

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Fission yeast Swil-Swi3 complex facilitates DNA binding of Mrc1.2010

    • Author(s)
      Tanaka, T., Yokoyama, M., Matsumoto, S., Fukatsu, R., You, Z., Masai, H.
    • Journal Title

      J.Biol.Chem.

      Volume: 285 Pages: 39609-39622

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Deregulated Cdc6 inhibits DNA replication and suppresses Cdc7-mediated phosphorylation of Mcm2-7 complex.2010

    • Author(s)
      Kundu, L.R., Kumata, Y., Kakusho, N., Watanabe, S., Furukohri, A., Waga, S., Sekia, M., Masai, H., Enomoto, T., Tada, S.
    • Journal Title

      Nucleic Acid Res.

      Volume: 38 Pages: 5409-5418

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Casein kinase 2-dependent phosphorylation of human Rad9 mediates the interaction between human Rad9-Hus1-Rad1 complex and TopBP1.2010

    • Author(s)
      Takeishi, Y., Ohashi, E., Ogawa, K, Masai, H., Obuse, C., Tsurimoto, T.
    • Journal Title

      Genes Cells

      Volume: 15 Pages: 761-771

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] DDK phosphorylates checkpoint clamp Rad9 and promotes its release from damaged Chromatin.2010

    • Author(s)
      Furuya, K., Miyabe, I., Tsutsui, Y., Paderi, F., Kakusho, N., Masai, H., Niki, H., Carr, A.M.(20
    • Journal Title

      Mol.Cell

      Volume: 40 Pages: 606-618

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Cdc7-Mediated Rad18 Phosphorylation Directs the Accumulation of DNA Polymerase η at Sites of Stalled Replication.2010

    • Author(s)
      Day, T.A., Palle, K., Barkley, L.R., Kakusho, N., Zou, Y., Tateishi, S., Verreault, A., Masai, H., Vaziri, C.
    • Journal Title

      J.Cell Biol.

      Volume: 191 Pages: 953-966

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Hsk1 kinase and Cdc45 regulate replication stress-induced checkpoint responses in fission yeast.2010

    • Author(s)
      Matsumoto, S., Shimmoto, M., Kakusho, N., Yokoyama, M., Russell, P., Masai, H.
    • Journal Title

      Cell Cycle

      Volume: 9 Pages: 4627-4637

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] FANCs regulate firing of DNA replication origins.2010

    • Author(s)
      Masai, H.
    • Journal Title

      Cell Cycle

      Volume: 9 Pages: 2494

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Integrating DNA replication with Trans-Lesion Synthesis via Cdc7.2010

    • Author(s)
      Vaziri, C., Masai H.
    • Journal Title

      Cell Cycle

      Volume: 9 Pages: 4818-4823

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] ASK.2010

    • Author(s)
      Toh G-T., Masai, H.
    • Journal Title

      UCSD-Nature Molecule Pages(Review)

      Volume: (Published online: 25 Feb 2009) Pages: doi:10.1038/mp.a000345.01

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Eukaryotic DNA replication ; where, when and how?2010

    • Author(s)
      Masai, H., Matsumoto, S., You, Z., Sugata-Yoshizawa, N., Oda, M.
    • Journal Title

      Annual.Rev.Biochem.

      Volume: 79 Pages: 89-130

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Stalled replication forks : Making ends meet for recognition and stabilization.2010

    • Author(s)
      Masai, H., Tanaka, T., Kohda, D.
    • Journal Title

      BioEssays

      Volume: 32 Pages: 687-697

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Bacterial primosome.2010

    • Author(s)
      Tanaka, T., Masai, H.
    • Journal Title

      Encyclopedia of Life Sciences

      Pages: DOI:10.1002/9780470015902.a0001048.pub2

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Bacterial replication fork.2010

    • Author(s)
      Tanaka, T., Masai, H.
    • Journal Title

      Encyclopedia of Life Sciences

      Pages: DOI:10.1002/9780470015902.a0001049.pub2

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Regulation of replication program and maintenance of genetic integrity.2010

    • Author(s)
      Masai, H., Yamazaki, S., Hayano, M., Kanoh, Y., Matsumoto, S., Kakusho, N., Ishii, A., Shimmoto, M., Oda, M., Yoshizawa, N., Ito, S., Kudo, S.(Organizer and speaker)
    • Organizer
      BMB2010 Symposium
    • Place of Presentation
      Kobe, Japan(招待講演)
    • Year and Date
      20101207-20101210
  • [Presentation] Cell Cycle and Mitosis.2010

    • Author(s)
      Masai, H.
    • Organizer
      Karolinska Institute RIKEN Joint Course 'Functional architecture of the cell nucleus
    • Place of Presentation
      RIKEN Yokohama(招待講演)(Invited lecture)
    • Year and Date
      20101124-20101130
  • [Presentation] Cell cycle regulation of embryonic stem cells regulating the maintenance of pluripotency and differentiation.2010

    • Author(s)
      Masai, H., Fujii, H., Kanoh, Y., Kakusho, N., Ito, S., Sawano, A., Miyawaki, A.
    • Organizer
      The 53^<rd> annual meeting of the Japan Radiation Society.(日本放射線影響学会)
    • Place of Presentation
      Kyoto, Japan(招待講演)
    • Year and Date
      20101020-20101022
  • [Presentation] Toward understanding the regulation of chromosome cycle by Cdc7 kinase.2010

    • Author(s)
      Masai, H.(Organizer and speaker)
    • Organizer
      The final symposium on Chromosome Cycle
    • Place of Presentation
      Hongo, Tokyo, Japan(招待講演)
    • Year and Date
      2010-10-01
  • [Book] 細胞周期の時空間的解析(細胞周期フロンティア)(佐方功幸、稲垣昌樹、岸本健雄編集)2010

    • Author(s)
      阪上-沢野朝子、正井久雄、宮脇敦史
    • Total Pages
      7
    • Publisher
      共立出版
  • [Book] なぜ親子は似るの?(なぜなぜ生物学)(MBSJ日本分子生物学会編)2010

    • Author(s)
      正井久雄
    • Total Pages
      15
    • Publisher
      東京化学同人
  • [Book] 生物学辞典 (分担)2010

    • Author(s)
      正井久雄
    • Publisher
      東京化学同人

URL: 

Published: 2012-07-19  

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