プロテインキナーゼの基質分子同定法の新規開発とその有用性の検討

2009 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21658119
• Research Institution: Nagahama Institute of Bio-Science and Technology
• Principal Investigator: 蔡 晃植 Nagahama Institute of Bio-Science and Technology, バイオサイエンス研究科, 教授 (00263442)
• Keywords: BiFC / プロテインキナーゼ / タンパク質リン酸化 / 分子間相互作用 / スクリーニング / MAPキナーゼ / 大腸菌 / カルシウム依存性プロテインキナーゼ

Research Abstract

本研究では、BiFC(Bimolecular fluorescence complementation)法を用いて特定のプロテインキナーゼの基質を網羅的に、かつ簡便に探索する方法を構築しその有用性を検証することを目的としている。本年度の研究では、まず、BiFCを用いたプロテインキナーゼの基質スクリーニングが可能かどうかを判定するため、プロテインキナーゼとその基質として明らかになっている、イネのOsMEK1(Mitogen-activated protein kinase kinase)とOsMAPKのC末端側にそれぞれVenusのN末端半分とC末端半分を融合したタンパク質を発現するベクターを作成し、これを同時に大腸菌に形質転換した。それぞれのベクターを導入した大腸菌を固体培地上で生育させた後、メンブレンにそのコロニーを転写し、IPTGを用いて両タンパク質を発現させ、実体蛍光顕微鏡でコロニーを観察した。その結果、両タンパク質が発現した大腸菌では、BiFC由来の蛍光が認められ、大腸菌を用いた本法がプロテインキナーゼのスクリーニングとして有用であることが確かめられた。さらに、VenusのC末端半分と融合した形で発現する植物のcDNAライブラリーを構築するために、すべての読み枠に対応した6種類の発現ベクターを作成した。このベクターを用いて予備的にcDNAライブラリーを作成し、BiFCによるスクリーニングを行ったところ、短い断片が挿入されたベクターでは非特異的なBiFC蛍光が認められることが明らかになった。このことは、作成するcDNAライブラリーのインサート長がある程度必要であることを示している。本法を用いてプロテインキナーゼの基質を探索する場合、使用するcDNAライブラリーはインサート長を調整することが必要であることが明らかになった。

Research Products

• [Journal Article] The transcription factor OsNAC4 is a key positive regulator of plant hypersensitive cell death. (2009)
  • Author(s): Kaneda, T., Taga, Y., Takai, R., Iwano, M., Matsui, H., Takayama, S., Isogai, A., Che F.S.
  • Journal Title: EMBO J. 28 Pages: 926-936
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Phosphocholine-containing glycosyl inositol-phosphoceramides from Trichoderma viride induce defense responses in cultured rice cells. (2009)
  • Author(s): Uchiyama, R., Aoki, K., Sugimoto, H., Taka, N., Katayama, T., Itonori, S., Sugita, M., Che, F.S., Kumagai, H., Yamamoto, K.
  • Journal Title: Biosci.Biotechnol.Biochem. 73 Pages: 74-78
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Role of OsHSP90 and IREN, Ca^<2+> dependent nuclease, in plant hypersensitive cell death induced by transcription factor OsNAC4. (2009)
  • Author(s): Taga, Y., Takai, R., Kaneda, T., Matsui, H., Isogai, A., Che, F.S.
  • Journal Title: Plant Signaling & Behavior 4 Pages: 1-3
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Coordination of plastid protein import and nuclear gene expression by plastid-to-nucleus retrograde signaling. (2009)
  • Author(s): Kakizaki, T., Matsumura, H., Nakayama, K., Che F.S., Terauchi, R., Inaba, T.
  • Journal Title: Plant Physiol. 151 Pages: 1339-1353
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 植物病因細菌Acidovorax avenae非病原性菌株のイネ免疫反応を誘導するエフェクタータンパク質の同定と機能解析 (2010)
  • Author(s): 近藤真千子, 乗京知宏, 宮田千加、蔡晃植
  • Organizer: 2010年度日本農芸化学会年回
  • Place of Presentation: 東京、東京大学
  • Year and Date: 2010-03-29
• [Presentation] 植物病原細菌Acidovorax avenaeのフラジェリンに存在する糖鎖のイネ免疫誘導特異性における役割 (2010)
  • Author(s): 平井洋行, 古川岳人, 磯貝彰, 蔡晃植
  • Organizer: 2010年度日本農芸化学会年回
  • Place of Presentation: 東京、東京大学
  • Year and Date: 2010-03-29
• [Presentation] 転写因子OsNAC4によって誘導される過敏感細胞死の機構解析 (2010)
  • Author(s): 大坪由佳、松井弘善、多賀有里、日比野孝紀、金田隆志、磯貝彰、蔡晃植
  • Organizer: 第51回日本植物生理学会年会
  • Place of Presentation: 熊本、熊本大学
  • Year and Date: 2010-03-20
• [Presentation] イネ免疫反応誘導時における細胞内Ca^<2+>の変化と免疫誘導へのOsCPKの関与 (2010)
  • Author(s): 神村麻友、藤原沙都姫、笹木亮志、濱本訓行、磯貝彰、高山誠司、蔡晃植
  • Organizer: 第51回日本植物生理学会年会
  • Place of Presentation: 熊本、熊本大学
  • Year and Date: 2010-03-20
• [Presentation] イネ免疫反応誘導に関与する植物病原細菌由来の新規エフェクタータンパク質の同定とその機能解析 (2009)
  • Author(s): 近藤真千子, 乗京知宏, 吉田裕貴, 察晃植
  • Organizer: 第32回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 横浜、パシフィコ横浜
  • Year and Date: 2009-12-10
• [Presentation] 植物病原細菌Acidovorax avenaeの鞭毛タンパク質フラジュリンに存在する糖鎖修飾と植物免疫誘導特異性への関与 (2009)
  • Author(s): 平井洋行, 古川岳人, 大坪由佳, 磯貝彰, 蔡晃植
  • Organizer: 第32回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 横浜、パシフィコ横浜
  • Year and Date: 2009-12-10
• [Presentation] 植物における病原細菌の鞭毛タンパク質フラジェリンの認識とその認識情報による免疫反応の誘導機構 (2009)
  • Author(s): 察晃植
  • Organizer: 自然免疫における普遍性と多様性
  • Place of Presentation: 東京、明治大学
  • Year and Date: 2009-09-14
• [Presentation] Induction mechanism of rice immune responses mediated by Hrp gene cluster of Acidovorax avenae (2009)
  • Author(s): Machiko Kondo, Tomohiro Norikyo, Fang-Sik Che
  • Organizer: The 4th Joint seminner of Marine Bio NURI Center, Pukyong National University and Pusan National University and Nagahama Institute of Bio-Science and Technology.
  • Place of Presentation: Busan, Republic of Korea
  • Year and Date: 2009-04-24
• [Presentation] Glycosylation of flagellin from Acidovorax avenae is involved in specific recogtnition by rice (2009)
  • Author(s): Takehito Furukawa, Hiroyuki Hirai, Rie Hashida, Fang-Sik che
  • Organizer: The 4th Joint seminner of Marine Bio NURI Center, Pukyong National University and Pusan National University and Nagahama Institute of Bio-Science and Technology.
  • Place of Presentation: Busan, Republic of Korea
  • Year and Date: 2009-04-24
• [Presentation] Cellular Ca2+ dynamics and role of OsCPKs in rice immune responses (2009)
  • Author(s): Mayu Kamimura, Ryoji Sasaki, Kuniyuki Hamamoto, Fang-Sik Che
  • Organizer: The 4th Joint seminner of Marine Bio NURI Center, Pukyong National University and Pusan National University and Nagahama Institute of Bio-Science and Technology.
  • Place of Presentation: Busan, Republic of Korea
  • Year and Date: 2009-04-24
• [Presentation] Plant Hypersensitive cell death mediated by transcription factor OsNAC4 (2009)
  • Author(s): Fang-Sik Che, Yuri Taga, Hiroyoshi Matsui, Takashi Kaneda
  • Organizer: The 4th Joint seminner of Marine Bio NURI Center, Pukyong National University and Pusan National University and Nagahama Institute of Bio-Science and Technology.
  • Place of Presentation: Busan, Republic of Korea
  • Year and Date: 2009-04-24