新たなアッセイによる循環系オーファン受容体の新規リガンド探索と機能解析

2009 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21659203
• Research Institution: University of Miyazaki
• Principal Investigator: 桑迫 健二 University of Miyazaki, フロンティア科学実験総合センター, 准教授 (20381098)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 加藤 丈司 宮崎大学, フロンティア科学実験総合センター, 教授 (20274780) ; 北村 和雄 宮崎大学, 医学部, 教授 (50204912) ; 永田 さやか 宮崎大学, 医学部, 特任助教 (00452920)
• Keywords: オーファン受容体 / 安定発現系 / FACS解析 / FRET解析 / 新規リガンド

Research Abstract

1. ヒトオーファン受容体の選定と安定発現系の樹立:
(1) オーファン受容体の選定およびクローニング:独自のRT-PCRで循環系の臓器に高発現しているオーファン受容体を選定し、PCRによるクローニングを行った。一部は市販のものを購入した。現在も残りの受容体のクローニングを進めている。
(2) オーファン受容体のタグ融合遺伝子の構築:HEK-293細胞に遺伝子導入したオーファン受容体が完全な形で細胞膜に発現したことを蛍光顕微鏡とFACS解析で確認するために、各遺伝子の5'端と3'端にそれぞれ約10個のアミノ酸残基からなるV5タグとクラゲの各蛍光タンパク(ECFP, EGFP, EYFP)の遺伝子を融合させた。
(3) オーファン受容体のタグ融合遺伝子の安定発現系の作製:オーファン受容体のタグ融合遺伝子をHHEK-293細胞に導入し、薬剤選別後に安定発現系のクローン化を行った。FACS解析で蛍光輝度の低い(受容体の発現の低い)クローンを2つ獲得した。現在も他の受容体のクローン化を進めている。
2. 選定したヒトオーファン受容体のリガンドの探索:
循環系の組織抽出液の獲得:循環系の内因性ペプチドが豊富に存在し、その精製が容易なヒトの褐色細胞腫もしくはブタの副腎を大量に抽出した。抽出は当教室で確立した方法を修飾して行った。
3. リガンド探索分野で報告例のないアッセイ(3種)の確立:
(1) オーファン受容体のリン酸化を利用したアッセイ法、(2) オーファン受容体の細胞内移行を利用したアッセイ法、(3)オーファン受容体の立体構造の変化を利用したアッセイ法に関して、様々な条件検討を行った。