2009 Fiscal Year Annual Research Report
神経縫合後の過誤支配の発生を低下させる局所療法の開発
| Project/Area Number |
21659408
|
|---|
| Research Institution | Hamamatsu University School of Medicine |
|---|
Principal Investigator |
宮崎 数史 Hamamatsu University School of Medicine, 医学部, リサーチアシスタント (10537418)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大野 浩司 浜松医科大学, 医学部, 准教授 (90263277)
|
|---|
| Keywords | 外科 / 神経科学 / 移植・再生医療 |
|---|
| Research Abstract |
CLP36結合蛋白の同定
野生型PC12細胞の1%Triton lysis bufferでホモジナイズし、可溶化蛋白の中からCLP36複合体を抗CLP36抗体(BD biosciences)-Dynabeads Protein G(Invitrogen)を用いて免疫沈降させた。この抗体が免疫沈降に使用できることは、すでに確認済みである(Tamura et al., BBRC 364 : 589-94, 2007)。沈降した蛋白群を0.5M NH4OH,0.5mM EDTAで溶出、SDS-PAGEによって分離・展開し、銀染色によってバンドとして可視化した。同時にコントロールとして、1)野生型PC12細胞に対しnormal IgGを使った免疫沈降、2)CLP36ノックダウンPC12細胞に対し抗CLP36抗体を使った免疫沈降、を施行し、これらの沈降産物との比較を行うことでCLP36複合体として現れている特異的なバンドを選び出した。
CLP36結合蛋白と見做されたバンドを、銀染色したゲルから1mmのブロックとして切り出し、還元化、アルキル化した後、トリプシン(Promega)によるゲル内消化を加えた。得られたペプチドをゲルから抽出し、LC-MS/MSによるペプチド酸配列の同定を行った。その結果をもとに検索エンジンを使い、蛋白の本体を明らかにしているところである。
GST-CLP36を使ったpulldown実験によって結合蛋白の沈降を行った。この方法で結合蛋白と思われるバンドが現れることを、すでに銀染色で観察しているが、pulldownで得られる蛋白は生理的な結合を反映しているかという点において免疫沈降法に比べ劣る部分がある。そのため、ここでは免疫沈降法を優先した実験を進める計画を立て、遂行しているところである。
|
