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2013 Fiscal Year Annual Research Report

タンパク質化学に立脚した革新的生細胞内分子分析法の創製

Research Project

Project/Area Number 21675001
Research InstitutionThe University of Tokyo

Principal Investigator

小澤 岳昌  東京大学, 大学院理学系研究科, 教授 (40302806)

Project Period (FY) 2009-05-11 – 2014-03-31
Keywords可視化 / ナノバイオ / 光スイッチ / バイオテクノロジー / 酵素反応
Research Abstract

テロメアRNAをターゲットとした1分子型蛍光プローブを開発した. テロメアRNAに特異的にPUM1変異体が結合すると, GFP再構成により蛍光が発するタンパク質を構築した. PUMI変異体とテロメアRNAとの解離定数, およびRNA配列に対する特異性を評価した. 生細胞内におけるテロメアRNAの1分子イメージングを, 全反射蛍光顕微鏡により可能にした. テロメアRNAが細胞内でダイナミックな挙動を示すことを初めて明らかにした. SUMO化修飾を受ける新規タンパク質の候補の一つであるATAC2の機能解析を行った. 先ず精製したATAC2を用いて, in vitro系でSUMO化修飾を受けることを実証した. さらにSUMO化を受けるアミノ酸残基の同定を行った. アミノ酸配列からSUMO化を受ける候補アミノ酸を選定し, Alaに置換した変異体を作製した. In vitroおよびin vivo系にてATAC2変異体のSUMO化を解析し, ATAC2の特定のアミノ酸がSUMO化を受ける事を明らかにした. さらにSUMO化に伴い相互作用するタンパク質を, MS解析により同定することに成功した.
Akt/PKBを光で制御するモジュール開発にこれまでに成功している. シグナルの下流分子であるアクチン重合に着目し解析を行った. 光によりAkt/PKB活性を細胞局所で活性化すると, その局所でアクチン重合起こり, 細胞が一方向に移動することが解った. また細胞全体に光照射しAkt/KBを活性化すると, 細胞膜のラッフリング現象を観測することができた. PIP3蛍光プローブを用いると, 膜のラッフリングとPIP3産生がカップルしていることを明らかにした. 様々な光刺激に対する細胞応答を定量化し, 光刺激とAkt/PKBの活性化パターンの相関関係を提示する数理モデルの構築に成功した.

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

本研究は, タンパク質の構造と機能に関する情報を最大限に活用し, 生体分子を光分析する独自の機能性タンパク質を創出する基盤技術の確立を目的としている. 3つの研究課題, 1)生きた細胞や生物個体内の生体分子の機能と動態を可視化する分子プローブの開発, 2)細胞内シグナル伝達に関与する新規分子種同定法, 3)生体分子の機能を時空間制御する機能性分子材料の開発いずれも, 当初の計画に加え, 新たな知見や技術開発・展開に繋がっている. 即ち, 細胞内pH測定やセカンドメッセンジャーであるPIP3発光分析法の開発, また神経軸索の光誘導技術はその代表例である.

Strategy for Future Research Activity

課題1のイメージングでは, 開発した蛍光・発光再構成技術の更なる応用展開が挙げられる. 特に単一細胞内における特定分子や相互作用の定量的検出は, 今後の生命科学研究の重要な課題であり期待される技術である. 検出感度, 精度の向上が重要な課題となる. 課題2の生体分子の同定は, 同定したSUMO化タンパク質の機能解析が挙げられる. ATAC2以外にも新たなSUMO化タンパク質の候補が得られている. これらの生化学的解析は緊急の課題である. 課題3の光操作は, タンパク質リン酸化酵素一般に敷衍することが重要な課題となる. 光操作技術の開発にとどまらず, 定量的にリン酸化酵素活性化ができることを, 数理モデルを用いて立証した. 光操作と数理モデルの融合は独自のアイデアであり, 今後その一般性を提示することが重要な課題となる.

  • Research Products

    (26 results)

All 2014 2013 Other

All Journal Article (12 results) (of which Peer Reviewed: 11 results) Presentation (13 results) (of which Invited: 13 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Long noncoding RNA NEAT1-dependent SFPQ relocation between nuclear body paraspeckle and promoter mediates IL8 expression in response to immune stimuli.2014

    • Author(s)
      K. Imamura, 他21名
    • Journal Title

      Mol. Cell

      Volume: 53 Pages: 393-406

    • DOI

      10.1016/j.molce1.2014.01.009.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] GPCRに作用する化合物のスクリーニング2014

    • Author(s)
      服部満, 田中みほ, 小澤岳昌
    • Journal Title

      Clinical Neuroscience

      Volume: 32 Pages: 128-129

  • [Journal Article] Assay methods for SUMO-SIM interactions in vivo and in vitro using a split-luciferase complementation system.2013

    • Author(s)
      M. Hirohama, A. R. Voet, T. Ozawa, H. Saitoh, Y. Nakao, K. Y. Zhang, A. Ito and M. Yoshida
    • Journal Title

      Anal. Biochem.

      Volume: 448 Pages: 92-94

    • DOI

      10.1016/j.ab.2013.12.009.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Bioluminescent Probes to Analyze Ligand-induced Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate Production with Split Luciferase Complementation.2013

    • Author(s)
      L. Z. Yang, Y. Nasu, M. Hattori, H. Yoshimura, A. Kanno, T. Ozawa
    • Journal Title

      Anal. Chem

      Volume: 85 Pages: 11352-11359

    • DOI

      10.1021/ac402278f.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] ROS stress resets circadian clocks to coordinate pro-survival signals.2013

    • Author(s)
      T. Tamaru, M. Hattori, Y. Ninomiya, G. Kawamura, G. Varbs, K. Honda, D. P. Mishra, B. Wang, I. Benjamin, P. Sassone-Corsi, T. Ozawa and K. Takamatsu
    • Journal Title

      PLaS ONE

      Volume: 8 Pages: E82006

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0082006

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Folding coupled with assembly in split green fluorescent proteins studied by structure-based molecular simulations.2013

    • Author(s)
      M. Ito, T. Ozawa and S. Takada
    • Journal Title

      J. Phys. Chem.

      Volume: 117 Pages: 13212-13218

    • DOI

      10.1021/jp4032817.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Sustained accurate recording of intracellular acidification in living tissues with a photo-controllable bioluminescent protein.2013

    • Author(s)
      M. Hattori, S. Haga, H. Takakura, M. Ozaki and T. Ozawa
    • Journal Title

      Proc. Natl. Acad. Sci. USA

      Volume: 110 Pages: 9332-9337

    • DOI

      10.1073/pnas.1304056110

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Spatiotemporal visualisation of proHB-EGF ectodomain shedding in living cells2013

    • Author(s)
      H. Inoue, T. Sakaue, T. Ozawa and S. Higashiyama
    • Journal Title

      J. Biochem.

      Volume: 154 Pages: 67-76

    • DOI

      10.1093/jb/mvt030

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Analysis of temporal patterns of GPCR-β-arrestin interactions using split luciferase-fragment complementation.2013

    • Author(s)
      M. Hattori, M. Tanaka, H. Takakura, K, Aoki, K. Miura, T. Anzai and T. Ozawa
    • Journal Title

      Mol. Biosystems

      Volume: 9 Pages: 957-964

    • DOI

      10.1039/c2mb25443c

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Longitudinal bioluminescence imaging of the dynamics of doxorubicin induced apoptosis2013

    • Author(s)
      G. Niu, L. Zhu, D. N. Ho, F. Zhang, H. Gao, Q. Quan, N. Hida, T. Ozawa, G. Liu and X. Chen
    • Journal Title

      Theranostics

      Volume: 3 Pages: 190-200

    • DOI

      10.7150/thno.5825

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Fabrication of Split-Luciferase Complementation Assays for Molecular Imagig2013

    • Author(s)
      S. B. Kim and T. Ozawa
    • Journal Title

      Curr. Mol. Imaging

      Volume: 2 Pages: 148-157

    • DOI

      10.2174/22115552113029990001

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] ホルモン診断に資するルミネセンス分析技術の進歩2013

    • Author(s)
      金誠培, 小澤岳昌, 長縄竜一
    • Journal Title

      ぶんせき

      Volume: 467 Pages: 678-686

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Imaging of Dynamic Molecules and Signaling in Living Cells2014

    • Author(s)
      T. Ozawa
    • Organizer
      Asian International Symposium of CSJ
    • Place of Presentation
      名古屋大学(愛知県)
    • Year and Date
      2014-03-28
    • Invited
  • [Presentation] Fluorescent and Luminescent Switches and Sensors2014

    • Author(s)
      T. Ozawa
    • Organizer
      BBSRC-Japanese Partnering Award Symposium
    • Place of Presentation
      マンチェスター大学(イギリス)
    • Year and Date
      2014-03-12
    • Invited
  • [Presentation] 生体分子と細胞内シグナルの可視化分析法2014

    • Author(s)
      小澤岳昌
    • Organizer
      第6回超高速時間分解光計測研究会
    • Place of Presentation
      浜松市(静岡県)
    • Year and Date
      2014-03-04
    • Invited
  • [Presentation] Protein Aggregation in Mitochondrial Apoptosis Revealed by Photoactivated Localization Microscopy2013

    • Author(s)
      T. Ozawa
    • Organizer
      SuperImaging
    • Place of Presentation
      浜松市(静岡県)
    • Year and Date
      2013-12-02
    • Invited
  • [Presentation] 生理機能を探る蛍光イメージングと新たな光分析法2013

    • Author(s)
      小澤岳昌
    • Organizer
      次世代マイクロ化学チップコンソーシアム第26回研究会
    • Place of Presentation
      東京大学(東京都)
    • Year and Date
      2013-10-22
    • Invited
  • [Presentation] Luminescence Imaging of Biological functions Using Split-Reporter Reconstitution Analyses2013

    • Author(s)
      T. Ozawa
    • Organizer
      The second international conference on the frontier research in organic synthesis and materials
    • Place of Presentation
      Taiwan (China)
    • Year and Date
      2013-09-22
    • Invited
  • [Presentation] Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Biological Functions Using Split-Reporter Reconstitution Analysis2013

    • Author(s)
      T. Ozawa
    • Organizer
      The 9^<th> International Forum on Post-Genome Technologies (9'IFPT)
    • Place of Presentation
      Shenzhen (China)
    • Year and Date
      2013-09-09
    • Invited
  • [Presentation] ルシフェラーゼ発光を利用した生理機能in vivoイメージング2013

    • Author(s)
      小澤岳昌
    • Organizer
      In vivoイメージングフォーラム2013
    • Place of Presentation
      東京大学(東京都)
    • Year and Date
      2013-09-06
    • Invited
  • [Presentation] Optical Imaging and Analysis of Cell-death Pathways Using Bioluminescent Proteins2013

    • Author(s)
      T. Ozawa
    • Organizer
      RSC Tokyo International Conference 2013
    • Place of Presentation
      幕張メッセ(千葉県)
    • Year and Date
      2013-09-05
    • Invited
  • [Presentation] Imaging and Control of Biological Functions Using Protein-Fragment Reconstitution analysis2013

    • Author(s)
      T. Ozawa
    • Organizer
      IEEE EMBC 2013 WorkShop
    • Place of Presentation
      Osaka International Convention Center (Japan)
    • Year and Date
      2013-07-03
    • Invited
  • [Presentation] Optical Control and Imaging of Biological Function in Live Cells2013

    • Author(s)
      T. Ozawa
    • Organizer
      Systems Biology of Cellular Signaling Symposium
    • Place of Presentation
      東京大学(東京都)
    • Year and Date
      2013-07-01
    • Invited
  • [Presentation] 生体分子の時空間制御とライブイメージング2013

    • Author(s)
      小澤岳昌
    • Organizer
      イメージングブートキャンプ2013
    • Place of Presentation
      北海道大学(札幌市)
    • Year and Date
      2013-06-18
    • Invited
  • [Presentation] Imaging and Control of Biological Functions Using Split-Reporter Reconstitution Analysis2013

    • Author(s)
      T. Ozawa
    • Organizer
      10^<th> Anniversary of Hwasun Optical Imaging Workshop & Symposium
    • Place of Presentation
      Gwanju (Korea)
    • Year and Date
      2013-05-28
    • Invited
  • [Remarks]

    • URL

      http://www.chem.s.u-tokyo.ac.jp/users/analyt/index.html

URL: 

Published: 2015-07-15  

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