コヒーシンサブユニットSMC3のアセチル化修飾動態の解析

2011 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21681025
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 加藤 由起 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 助教 (50391917)
• Keywords: コヒーシン / アセチル化 / ChIP-seq解析

Research Abstract

コヒーシン(姉妹染色体接着因子)複合体は、S期で複製が進むに連れて出来る姉妹染色体分体が離ればなれにならないようつなぎ止めておく重要な役割を担っており、高度に保存されている。コヒーシンはS期で合成され始め、分裂期に段階的に解離するが、S期のメインイベントである複製とコヒーシン因子がどのように連動しているのかは未だ明らかになってはいない。しかし、コヒーシン複合体を構成する因子の一つである、Smc3のアセチル化がS期が開始されてから起こる事、またこのアセチル化も高度に保存されている事が、最近明らかになってきた。そこで当研究室ではアセチル化されたSmc3を認識する抗体を作成し、Smc3のアセチル化がどのような意義を持つのかを明らかにする事により、S期におけるコヒーシンと複製の関連性の解明を目指してきた。この抗体(出芽酵母のアセチル化Smc3を認識する抗体)を用いアセチル化Smc3の分布を調べるために、免疫沈降を行ったが、出芽酵母のアセチル化Smc3抗体では、上手く免疫沈降を行う事が出来なかった。そこで、当研究室で免疫沈降も行える事が明らかになっているヒト細胞のアセチル化Smc3サイトを認識する抗体を使用する為に、出芽酵母のSmc3のアセチル化認識サイトをヒト細胞アセチル化Smc3抗体で認識出来るように、作り替えた株を作製し、ヒト細胞用アセチル化Smc3抗体を使用して免疫沈降を行った所、免沈が出来ている事を確認出来た。そこで、今はこのヒトアセチル化Smc3サイトを持つ株を使用して、ChIP-seqを行い、アセチル化Smc3サイトの同定を試みている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

今まで、出芽酵母用の抗体を用い、全く免疫沈降が出来なかったが、ヒトアセチル化Smc3抗体を認識する株を作製し、免疫沈降が成功した。

Strategy for Future Research Activity

上記のように、免疫沈降法で上手く行ったので、これからはアセチル化Smc3がS期のどの段階で、その部位に結合して来るのかをChIP-seq法を用い、確認する。

Research Products

• [Journal Article] Endogenous DNA replication stress results in expansion of dNTP pools and a mutator phenotype (2012)
  • Author(s): Davidson MB, Katou Y, Keszthelyi A, Sing TL, Xia T, Ou J, Vaisica JA, Thevakumaran N, Marjavaara L, Myers CL, Chabes A, Shirahige K, Brown GW
  • Journal Title: EMBO J. Volume: 31(4) Pages: 895-907
  • DOI: 10.1038/emboj.2011.485
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] ATP hydrolysis is required for relocating cohesin from sites occupied by its Scc2/4 loading complex (2011)
  • Author(s): Hu B, Itoh T, Mishra A, Katoh Y, Chan KL, Upcher W, Godlee C, Roig MB, Shirahige K, Nasmyth K
  • Journal Title: Curr Biol Volume: 21(1) Pages: 12-24
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Chromosome length influences replication-induced topological stress (2011)
  • Author(s): Kegel A, Betts-Lindroos H, Kanno T, Jeppsson K, Strom L, Katou Y, Itoh T, Shirahige K, Sjogren C
  • Journal Title: Nature Volume: 471(7338 Pages: 392-396
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The replication checkpoint protects fork stability by releasing transcribed genes from nuclear pores (2011)
  • Author(s): Bermejo R, Capra T, Jossen R, Colosio A, Frattini C, Carotenuto W, Cocito A, Doksani Y, Klein H, Gomez-Gonzalez B, Aguilera A, Katou Y, Shirahige K, Foiani M
  • Journal Title: Cell Volume: 146(2) Pages: 233-246
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Origin association of Sld3, Sld7, and Cdc45 proteins is a key step for determination of origin-firing timing (2011)
  • Author(s): Tanaka S, Nakato R, Katou Y, Shirahige K, Araki H
  • Journal Title: Curr Biol Volume: 21(24) Pages: 2055-2063
  • Peer Reviewed