タイトジャンクション制御における新規受容体・シグナル伝達解析とその応用

2009 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21710219
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 南雲 陽子 University of Tsukuba, 大学院・生命環境科学研究科, 助教 (70373339)
• Keywords: タイトジャンクション / コフィリン / 生理活性

Research Abstract

本研究はカプサイシンがCaco-2腸管上皮モデルの物質透過性を上昇させる点に着目し、TJ開放シグナル伝達機構の総括的な理解を示す。そのためにはこれまでに明らかになっている四点、1)カプサイシン刺激、2)Ca^<2+>イオンの流入、3)Cofilin脱リン酸化によるアクチン骨格変動、及び4)TJ開放の、詳細な解析を行うとともに、相互の関係を結ぶ分子機構として、I)腸管上皮細胞におけるカプサイシン認識/Ca^<2+>イオン流入の解析:TRPV1様分子についての基礎研究、II)Cofilinの脱リン酸化につながるシグナル伝達経路の解明、III)アクチン骨格変動に伴うTJ構成タンパク質変動解析、の研究を平行して行うことにより、TJ開放制御機構についての情報を得ることを目指す。平成21年度はI)についてはTRPV1様分子を培養細胞に導入する検討を行いその発現を確認した。II)については、阻害剤を用いた検討によりCofilinの上流に存在すると考えられる因子を探索した。III)については、TJ構成タンパク質のうち、Claudin-1、Occludin、Zo-1について免疫蛍光染色し、顕微鏡で各タンパク質の局在変動を追跡した。以上の解析からTJ開放シグナル伝達機構解明につながる糸口を見出せたので、来年度は各機構の連携を中心に解析を進める。
また一連の検討を行う上で問題であった、Caco-2細胞がトランスフェクションされづらく、単層状に培養するのに時間がかかる点、TERによる透過性測定が煩雑である点の解決を検討した。より培養時間の短いMDCK細胞を用い、蛍光ラベルした透過物質による透過性測定系を作り、カプサイシンによる透過性上昇の確認を行い、測定法の簡便化に成功した。これにより透過性が上昇する物質の特性についても知見を得た。