2009 Fiscal Year Annual Research Report
分裂酵母の接合型変換組換え反応の試験管内再構築系による機能解析
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21770007
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
村山 泰斗 Tokyo Institute of Technology, 大学院・生命理工学研究科, グローバルCOE研究員 (60531663)
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| Keywords | 接合 / 相同組換え / 試験管内再構成 / 生化学 / ヘテロクロマチン / Rad51 / mat座位 / 非対称分裂 |
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| Research Abstract |
本研究は、分裂酵母Swi2-Swi5複合体依存的な接合型変換相同組換え反応を試験管内再構成し、その機構の解明を目的とする。平成21年度は、1. Swi2-Swi5複合体の精製法の確立、2. Swi2のDNA結合ドメインの解析、3. Swi2結合タンパク質との結合部位の同定、の解析を行った。それぞれの進捗状況は以下の通りである。
1. 大腸菌発現システムでSwi2-Swi5複合体の発現は可能であったが、分解産物が多く、これを改善する必要があった。これに代わる方法として昆虫細胞発現系、及び無細胞発現系を試みたが大腸菌発現系と同様にSwi2の分解を防ぐことはできなかった。これに平行し、Swi2と結合するSwi6を加えたSwi2-Swi5-Swi6の共発現・精製を行ったが、大幅な改善は見られなかった。これらの原因として、Swi2と結合・安定化する未同定のタンパク質の存在が推測される。現在分裂酵母からの直接精製の準備を行っている。
2. ATフックドメインを含むSwi2のN末端部N1(1-400アミノ酸)及びN2(81-320アミノ酸)の精製に成功し、これらのDNA結合能をEMSA法で比較した。N2はN1より結合能が1/5程度減弱していたことから、DNA結合にはATフックを含むかなり広域が必要であることが判明した。また、ゲル濾過解析からN1は単量体より高分子側に存在する画分が存在することが判明し、Swi2が多量体で機能する可能性が示唆される。
3. Swi2の高密度部分欠失変異タンパク質を作成し、Swi5との共発現を指標にSwi5結合領域の同定を行った。その結果、Swi2 621-722アミノ酸部分がSwi5との結合に必須部位であることが判明した。また、Swi2 361-722アミノ酸部分(Rad51結合領域を含む)をSwi5との複合体として精製することに成功した。
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