2010 Fiscal Year Annual Research Report
病原菌の新規「タイプ6分泌装置」蛋白質群にみられる収縮性ファージと共通の立体構造
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21770164
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
金丸 周司 東京工業大学, 大学院・生命理工学研究科, 助教 (50376951)
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| Keywords | グラム陰性菌 / 分泌装置 / バクテリオファージ / 構造解析 / T6SS / βヘリックス / VgrG |
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| Research Abstract |
1.大腸菌CFT073 Vgr蛋白質の発現系の作製
PCRで大腸菌CFT073ゲノムよりvgrG遺伝子を増幅した後にpUC18ベクターでクローニングをした。その後vgrG遺伝子をpET29aベクターへ移して発現用ベクターとした。なお発現ベクターは各VgrG蛋白質につきC末端にHis-tagを付加したもの(-hisと表記)と野生型のもの(WTと表記)の2種類を作成した。
2.大腸菌CFT073のVgrG蛋白質の発現・可溶化・精製
大腸菌CFT037のVgrG蛋白質の発現ベクターを用いてBL21(DE3)を形質転換し、37℃のLB培地で1mMのIPTGにより発現誘導を行った。集菌した菌体を超音波破砕して遠心により可溶性画分と不溶性画分に分けたところ発現は見られたものの大部分が不溶性画分に存在していた。このため発現温度などを変えてVgrG蛋白質の可溶化を検討したところVgrG-c3393-hisにおいて25℃のLB培地、0.1mM～1mMのIPTGでおよそ2割程度を可溶性画分に回収できた。しかしながらVgrG-c1883-his、VgrG-c1888-hisは依然として可溶性画分の収率が悪く精製を行うには至らなかった。可溶性画分に得られたVgrG-c3393-hisはNiアフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーで精製を行った。
3.VgrG-c3393-hisの性状解析
精製したVgrG-c3393-hisのCDスペクトルを測定し解析プログラムCONTINLLで解析したところ、βシート構造に富んでいることが分かった。
次にVgrG1-hisを沈降速度法により分析し、データをSEDFITで解析したところ沈降係数の分布関数c(s)は、9.1S(95%)の主要ピークが得られた。c(s)をc(M)に変換した結果、9.1Sの主要ピークは247kDaを示し、VgrG-c3393-his(92kDa)は3量体を形成していると結論された。
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[Journal Article] Dual modification of a triple-stranded β-helix nanotube with Ru and Remetal complexes to promote photocatalytic reduction of CO2.2011
Author(s)
Yokoi N, Miura Y, Huang CY, Takatani N, Inaba H, Koshiyama T, Kanamaru S, Arisaka F, Watanabe Y, Kitagawa S, Ueno T.
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Journal Title
Chem Commun (Camb)
Volume: 47
Pages: 2074-2076
Peer Reviewed
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[Journal Article] Construction of robust bio-nanotubes using the controlled self-assembly of component proteins of bacteriophage T4.2010
Author(s)
Yokoi N, Inaba H, Terauchi M, Stieg AZ, Sanghamitra NJ, Koshiyama T, Yutani K, Kanamaru S, Arisaka F, Hikage T, Suzuki A, Yamane T, Gimzewski JK, Watanabe Y, Kitagawa S, Ueno T.
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Journal Title
Small
Volume: 6
Pages: 1873-1879
Peer Reviewed
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