2011 Fiscal Year Annual Research Report
試験管内再現系を用いた、クロマチンの構造制御/転写活性制御の解析
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21770167
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| Research Institution | National Institute of Genetics |
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Principal Investigator |
日詰 光治 国立遺伝学研究所, 細胞遺伝研究系, 助教 (10378846)
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| Keywords | クロマチン / ヌクレオソーム / 原子間力顕微鏡 / DNA複製 |
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| Research Abstract |
遺伝子の転写活性が高いクロマチン領域は複製開始の時期が他の領域と比較して早期であるなど、遺伝子活性とDNA複製との相関性についてはこれまでの多くの報告がなされている。本研究では、遺伝子活性と相関したクロマチン構造の研究のアプローチとして、「クロマチン構造とDNA複製制御」に焦点を絞り、本年度は研究を遂行した。
<複製開始の制御(ORCの複製開始点(ARS)領域への特異的結合)における、ヌクレオソームの役割の追究>
真核生物の複製はゲノム上の複数の位置から開始されるが、その開始領域のDNA配列が特定されている実験生物は出芽酵母だけである。本研究では、出芽酵母のARSを含むDNA上にクロマチン再構成を行い、複製開始領域結合因子であるORC(Origin Recognition Complex)を加え、生化学的解析および原子間力顕微鏡による観察を行なった。その結果、DNAを用いるよりもクロマチンを用いた方が、ORCとARSのDNA配列特異的な結合が促進される様子が検出された。また、ORCを加えることによりARS付近のヌクレオソームのポジショニングが影響を受けること、さらに、ORCは、リンカーDNAとヌクレオソームとの二つの結合を両立して安定にARS上に結合することが示唆された。
前記のように、複製開始領域のDNA配列のモチーフが酵母以外で見つからなかったことから、"クロマチン構造が複製開始点の決定に影響を及ぼしている"というモデルはこれまでに提唱されていたが、本研究において初めて、クロマチンがORCとARSとの結合の特異性と安定性に寄与するという実験的証明を行なった。
<Pre-RCのクロマチン上での試験管内再構成>
ORCに引き続いて複製開始領域に集合するCdc6,Cdt1,MCM複合体のAFM観察を開始した。これら因子を、ORCとともにDNAに添加し、AFM観察を行なったところ、ORCよりも大きな複合体がDNA上に形成されている様子が検出された。今後、本実験条件を改良し、複合体の会合様式(観察された大きな複合体内でのMC賊複合体の空間配位)を同定することを目指す。
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