オンデマンド型水酸化アミノ酸生産を目指した新規微生物酵素の包括的スクリーニング

2010 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21780070
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 日比 慎 京都大学, 農学研究科, 助教 (30432347)
• Keywords: ジオキシゲナーゼ / 水酸化アミノ酸 / 微生物 / 水酸化酵素 / 基質特異性 / スクリーニング / キラルアルコール / N置換アミノ酸

Research Abstract

有用な生理活性を持ち医薬品や食品用途などへの利用が期待されている水酸化アミノ酸類を効率的に生産する酵素変換法の開発に取り組んだ。前年度までに取得したBacillus thuringiensis 2e2株由来ジオキシゲナーゼ(IDO)、Nostoc punctiforme PCC73102株由来ジオキシゲナーゼ(LdoA)、及びBurkholderia ambifaria AMMD株由来の2種のジオキシゲナーゼ(SadA, SadB)について詳細な基質特異性解析と反応産物の構造決定を実施した。IDOは疎水性の脂肪族L体アミノ酸類の4位炭素に水酸基を導入し、(S)-4-hydroxy-L-isoleucine, (S)-4-hydroxy-L-norvaline, 4-hydroxy-L-norleucine, 4-hydroxy-L-leucineなどを生成する事を明らかにした。またLdoAはL-leucineとL-norleucineの5位炭素に水酸基を導入し、それぞれ(4S)-5-hydroxy-L-leucine, 5-hydroxy-L-norleucineを生成する事を明らかにした。さらにSadAとSadBは共にN置換の疎水性脂肪族L体アミノ酸類の3位炭素に水酸基を導入し、N-succinyl-3-hydroxy-L-leucineなどを生成することを明らかにした。この様に各ジオキシゲナーゼは基質特異性が大きく異なり、特にL-leucine(誘導体)に関しては3位、4位、5位水酸化体を個別に作り分ける事ができる様になった。本年度で見出されたジオキシゲナーゼによるアミノ酸水酸化活性は全くの新規反応であり、また何れの反応においてもその立体特異性は高く、キラル水酸化アミノ酸の生産のための産業用酵素触媒として非常に優れていることを発見できた。

Research Products

• [Journal Article] Metabolic engineering of Escherichia coli to produce(2S,3R,4S)-4-hydroxyisoleucine (2010)
  • Author(s): Smirnov SV, Kodera T, Samsonova NN, Kotlyarova VA, Rushkevich NY, Kivero AD, Sokolov PM, Hibi M, Ogawa J, Shimizu S.
  • Journal Title: Applied Microbiology and Biotechnology Volume: 88 Pages: 719-726
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A novel L-isoleucine metabolism in Bacillus thuringiensis generating (2S,3R,4S)-4-hydroxyisoleucine, a potential insulinotropic and anti-obesity amino acid (2010)
  • Author(s): Ogawa J, Kodera T, Smirnov SV, Hibi M, Samsonova NN, Koyama R, Yamanaka H, Mano J, Kawashima T, Yokozeki K, Shimizu S.
  • Journal Title: Applied Microbiology and Biotechnology Volume: 89 Pages: 1929-1938
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Bacillus thuringiensis 2e2株由来L-isoleucine dioxygenaseによる有用アミノ酸の立体選択的合成 (2011)
  • Author(s): 日比慎、河嶋隆志、清水昌、横関健三、小川順
  • Organizer: 日本農芸化学会2011年度大会
  • Place of Presentation: 京都女子大学(京都府)
  • Year and Date: 2011-03-26
• [Presentation] Burkholderia ambifaria AMMD株由来新規dioxygenaseの機能解析及び反応生成物の同定 (2011)
  • Author(s): 河嶋隆志、日比慎、横関健三、清水昌、小川順
  • Organizer: 日本農芸化学会2011年度大会
  • Place of Presentation: 京都女子大学(京都府)
  • Year and Date: 2011-03-26
• [Presentation] 微生物由来新規アミノ酸水酸化酵素の基質特異性解析及び生成物の同定 (2010)
  • Author(s): 河嶋隆志, 日比慎, 横関健三, 清水昌, 小川順
  • Organizer: 第62回日本生物工学会大会
  • Place of Presentation: 宮崎シーガイヤ(宮崎県)
  • Year and Date: 2010-10-28
• [Presentation] Application of microbial enzymes in the production of functional hydroxy amino acids (2010)
  • Author(s): Hibi M, Ogawa J, Yokozeki K, Shimizu S
  • Organizer: The 12th Japanese-Swiss Meeting on Biotechnology and Bioprocess Development
  • Place of Presentation: 富山国際会議場(富山県)
  • Year and Date: 2010-10-11
• [Patent(Industrial Property Rights)] METHOD FOR PRODUCING HYDROXYLATED AMINO ACIDS (2011)
  • Inventor(s): SMIRNOV, S.V.SAMSONOVA, N.N., KOTLIAROVA, V.A., RUSHKEVICH, N.Y., FEDORINA, E.A., SOKOLOV, P.M., KOLOKOLOVA, A.V., OGAWA, J., HIBI, M., SHIMIZU, S., IMABA YASHI, Y., SUZUKI S., SUGIYAMA, M.
  • Industrial Property Rights Holder: AJINO MOTO CO., INC.
  • Industrial Property Number: WO/2011/021717
  • Filing Date: 2011-02-24
  • Overseas
• [Patent(Industrial Property Rights)] METHOD FOR PRODUCING HYDROXYLATED AMINO ACIDS (2010)
  • Inventor(s): SMIRNOV, S.V.SAMSONOVA, N.N., KOTLIAROVA, V.A., RUSHKEVICH, N.Y., FEDORINA, E.A., SOKOLOV, P.M., KOLOKOLOVA, A.V., OGAWA, J., HIBI, M., SHIMIZU, S., IMABA YASHI, Y., SUZUKI S., SUGIYAMA, M.
  • Industrial Property Rights Holder: AJINO MOTO CO., INC.
  • Industrial Property Number: WO/2011/021717
  • Acquisition Date: 2010-08-18
  • Overseas