2011 Fiscal Year Annual Research Report
天然変性蛋白質PQBP1のセグメントラベルとNMRによる分子認識機構の解明
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21790034
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
水口 峰之 富山大学, 大学院・医学薬学研究部(薬学), 教授 (30332662)
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| Keywords | タンパク質 / 生体分子 / 天然変性蛋白質 / NMR |
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| Research Abstract |
本研究では、天然変性蛋白質PQBP-1のセグメントラベル体について動的構造解析を行う。今年度は、PQBP-1(1-219)の非標識体とPQBP-1(220-265)の^<15>Nラベル体を別々に発現・精製し、これらのフラグメントを連結させることにより、PQBP-1の220-265残基をセグメントラベルしたタンパク質を得ることに成功した。
PQBP-1(1-219)/pTWIN1ベクターをテンプレートとして、pQBP-1(1-219)-Intein-CBDをコードするDNA配列をPCRによって増幅し、pColdIベクター(TAKARA)に挿入した。同様に、CBD-Intein-PQBP-1(220-265)をコードするDNA配列もpCold Iベクターに挿入した。目的のDNA配列が挿入されたことを確認し、大腸菌C43(DE3)、またはBL21(DE3)を形質転換して培養した。このとき、CBD-Intein-PQBP-1(220-265)は^<15>N標識する必要があるため、^<15>N塩化アンモニウムを含む最小培地で培養した。一方、PQBP-1(1-219)-Intein-CBDの場合は^<15>Nラベルの必要がないため非標識培地で培養した。これらの融合タンパク質を、キチン結合カラムによるアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、2-mercaptoethanesulfbnic acid(MESNA)で処理した。これにより、PQBP-1(1-219)とPQBP-1(220-265)をCBD-Inteinから切り離すことができた。その後、PQBP-1(1-219)とPQBP-1(220-265)を連結し、連結したタンパク質をHPLCによって精製した。連結の反応条件を検討し、20m MHEPES(pH8.0),10mM MESNAの存在下、37℃で反応させる条件が最適であることがわかった。
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