2009 Fiscal Year Annual Research Report
癌血管内皮細胞を標的とした組織特異的siRNA発現システムの開発とその評価
Project/Area Number |
21790161
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Research Institution | Showa Pharmaceutical University |
Principal Investigator |
小泉 直也 Showa Pharmaceutical University, 薬学部, 助教 (80433845)
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Keywords | 癌遺伝子治療 / RNAi / ターゲティング / 血管内皮細胞 / 薬学 |
Research Abstract |
初年度において、申請者らが開発したRNAポリメラーゼIIプロモーター(CMVプロモーター)により標的分子のsiRNA配列を含んだmiRNAを発現するVSV-Gレンチウイルスベクターが、培養細胞に発現させたルシフェラーゼ発現量を低下させることを確認した。そこで、造血幹細胞においても機能可能なユビキチンプロモーターにて標的分子のsiRNA配列を含んだmiRNAを発現するレンチウイルスベクターを作製した。その結果、CMVプロモーターよりも転写効率の低いユビキチンプロモーターではノックダウン効果がほとんど現れないことが明らかとなった。組織特異的プロモーターの転写効率はユビキチンプロモーターよりもさらに低いことが予想され、申請者らが開発したsiRNA配列を含んだmiRNA発現カセットでは、目的分子を効率的にノックダウンすることは難しいと判断した。そこで、siRNAを組み込むRNAをmiRNAからアデノウイルス由来のスモールRNAに変更したところ、RNAポリメラーゼIIIプロモーター(H1プロモーター)では、効率的に内在性蛋白質のノックダウンが可能であった。そこで本年度においては、初年度に開発したアデノウイルス由来のスモールRNAにsiRNA配列を組み込んだsiRNA発現カセットを、RNAポリメラーゼIIプロモーター(ユビキチンプロモーター)にてドライブするレンチウイルスベクターを開発する。さらに、内在性蛋白質の発現量を指標に、培養細胞でのノックダウン効果を評価する。レンチウイルスベクターによる標的蛋白質のノックダウン効果が確認された後、組織特異的プロモーターを用いた検討を行う。さらに、マウスin vivo実験を行うことで、動物個体での機能評価を行う。
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