C型とD型ボツリヌス菌ホスホリパーゼCの三次元構造と機能解析

2010 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21790421
• Research Institution: University of Miyazaki
• Principal Investigator: 阪口 義彦 宮崎大学, IR推進機構, 助教 (70403491)
• Keywords: ボツリヌス菌 / ホスホリパーゼC / ウエルシュ菌α毒素 / 卵黄活性 / 溶血活性 / ホスファチジルコリン / スフィンゴミエリン / リポソーム

Research Abstract

ボツリヌス菌は、産生する神経毒素の抗原性の違いによりA～G型に分かれる。これらのうち、C型とD型菌のみホスホリパーゼC(PLC)を産生する。一方、ウエルシュ菌α毒素はガス壊疽の病原因子であり、PLCとスフィンゴミエリナーゼの酵素活性を有している。C型とD型PLC遺伝子の全塩基配列を決定したところ、アミノ酸レベルでα毒素と53%の相同性を示し、酵素活性に重要なZn^<2+>結合モチーフもよく保存されていた。そこで、D型PLC (Dbot α)を組換えタンパク質として発現・精製を行い、酵素活性と生物活性を測定しα毒素と比較した。CoCl_2存在下で卵黄活性では同程度の活性を示したが、ウサギ赤血球を用いた溶血活性においては著しく低かった。ウサギ赤血球膜への結合、BIAcoreを用いたPCとDbot αとの親和性を調べたところ、強い結合が認められた。一方、マウスの致死活性では,著しく低かった。現在、Dbot αの結晶化に成功したので構造解析を進めている。
C型とD型菌の中でも卵黄活性を示さないD-4947株とD-SA株を得たので、そのPLC遺伝子の全塩基配列についても決定した。これらのPLCをアミノ酸レベルで比較したところ、2株ともα毒素と47%の相同性を示しZn^<2+>結合モチーフもよく保存されていた。D-4947株とD-SA株において、菌体内のPLC発現を調べるため、ウサギ抗Dbot α抗体を用いてウエスタンブロッティング解析を行ったところ、推定した分子量(46kDa)以外に約30kDaの位置にも強いシグナルが検出された。このことから、2株についてはPLCを産生するが、菌体内のプロテアーゼにより分解を受けていることが推察された。
今後、既知のα毒素の立体構造をもとにDbot αの構造解析を行い、酵素活性に重要なアミノ酸残基を調べ、クロストリジウム属の病原性の解明に大いに貢献したいと考えている。

Research Products

• [Journal Article] A new cytosolic pathway from a Parkinson disease-associated kinase, BRPK/PINK1 : activation of AKT via mTORC2 (2011)
  • Author(s): Murata, H., Sakaguchi, M., Jin, Y., Sakaguchi, Y., Futami, J.I., Yamada, H., Kataoka, K., Huh, N.H.
  • Journal Title: J.Biol.Chem. Volume: 286 Pages: 7182-7189
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Transcriptional regulation of a brown adipocyte-specificgene, UCP1, by KLF11 and KLF15 (2010)
  • Author(s): Yamamoto, K., Sakaguchi, M., Medina, R.J., Niida, A., Sakaguchi, Y., Miyazaki, M., Kataoka, K., Huh, N.H.
  • Journal Title: Biochem.Biophys.Res.Commun. Volume: 400 Pages: 175-180
  • Peer Reviewed
• [Presentation] ボツリヌス菌ホスホリパーゼCの酵素活性と生物活性 (2010)
  • Author(s): 阪口義彦, 小田真隆, Ni Nengah Dwi Fatmawati, 山本由弥子, 唐澤忠宏, 小林敬子, 永浜政博, 櫻井純, 小熊恵二
  • Organizer: BMB2010,第33回日本分子生物学会年会・第83回日本生化学会大会 合同大会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド(神戸)
  • Year and Date: 20101207-20101210
• [Presentation] 多機能受容体RAGEの下流信号伝達機構の解明 (2010)
  • Author(s): 阪口政清, 村田等, 山本健一, 小野智之, 阪口義彦, 本山晃, 日比野利彦, 片岡健, 許南浩
  • Organizer: BMB2010,第33回日本分子生物学会年会・第83回日本生化学会大会 合同大会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド(神戸)
  • Year and Date: 20101207-20101210
• [Presentation] A型ボツリヌス神経毒素の三叉神経節培養細胞への結合と取り込み (2010)
  • Author(s): 山本由弥子, 張凱, Ni Nengah DwiFatmawati, 申蓮花, 馬少博, 阪口義彦, 鈴木智典, 小熊惠二
  • Organizer: 第63回日本細菌学会中国・四国支部総会
  • Place of Presentation: 松山大学(松山市)
  • Year and Date: 20101016-20101017
• [Presentation] C型とD型ボツリヌス毒素を支配するバクテリオファージのゲノム解析 (2010)
  • Author(s): 阪口義彦
  • Organizer: 第3回ファージ研究会
  • Place of Presentation: 大阪大学蛋白質研究所(大阪)
  • Year and Date: 20100909-20100910
• [Presentation] ボツリヌス菌ホスホリパーゼCの酵素活性と生物活性 (2010)
  • Author(s): 阪口義彦, 小田真隆, Ni Nengah Dwi Fatmawati, 山本由弥子, 難波ひかる, 唐澤忠宏, 小林敬子, 永浜政博, 櫻井純, 小熊恵二
  • Organizer: 第57回トキシンシンポジウム
  • Place of Presentation: 長浜ロイヤルホテル(滋賀)
  • Year and Date: 20100714-20100716