機能未知輸送体群の抗癌剤輸送への関与を中心とした機能解析

2009 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21790530
• Research Institution: University of Niigata Prefecture
• Principal Investigator: 神山 伸 新潟県立大学, 人間生活学部, 助教 (70525401)
• Keywords: 遺伝子 / 癌 / 輸送体 / 薬剤反応性 / 抗癌剤

Research Abstract

大腸癌由来細胞であるDLD-1、胚性腎臓癌細胞のHEK293、肝臓癌由来細胞のHepG2、子宮癌由来細胞のHelaよりRNAを抽出し、逆転写によりcDNAを調製した。これらの6bNAからPCRによってSLC35F2, SLC35E5, SLC35F6遺伝子を取得した。SLC35F1, SLC35F3, SLC35F4に関しては、複数のcDNAとプライマーを組み合わせて試みたが、取得することができなかった。
これらの取得した遺伝子を細胞内に発現させるため、DCDNA3.1ベクターを改変し、N末端あるいはC末端にFLAG, HA, c-mycタグを付加させるための発現ベクターを作成した。取得した遺伝子のそれぞれを、これらの発現ベクターに組み換えた。
これらのベクターに組みこんだ遺伝子をDLD-1包に一過性させ、HAタグに対する抗体で細胞内免疫染色を行い、発現を確認した。SLC35F2とSLC35F6遺伝子に関しては、一過性発現により細胞内の発現が確認されたが、SLC35F5遺伝子に関しては、N末タグ、C末タグのいずれでも、発現が認められなかった。
これらの遺伝子を、5-FUに耐性を持つ大腸癌由来細胞であるDLD-1細胞に安定発現させ、HAタグに対する細胞内染色により、これらの組換えタンパク質を高発現しているクローンを取得した。得られた安定発現細胞について、5-FUに対する耐性に変動がみられるかどうかを順次検討している。