2010 Fiscal Year Annual Research Report
p53ドミナント・ネガティブ変異体の同定および機能解析
Project/Area Number |
21790620
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Research Institution | Akita University |
Principal Investigator |
大塚 和令 秋田大学, 大学院・医学系研究科, 講師 (90375072)
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Keywords | 内科 / TP53遺伝子 |
Research Abstract |
野生型p53発現プラスミドを栄養要求性マーカーHIS、URA3を利用してα接合型出芽酵母株に導入した。一方、網羅的p53ミスセンス変異ライブラリーは、a接合型出芽酵母株YPH499に2314種類の変異TP53発現プラスミドとEGFPレポータープラスミドをそれぞれ栄養要求性マーカーLEU2、TRP1を利用して導入した。尚EGFPレポータープラスミドにはWAF1のp53応答配列を挿入してある。α接合型出芽酵母株と2314種類のYPH499株をYPDプレート上で接合したコロニーをSC-trp-1eu-his-uraプレートと5-FOA含有SC-trp-leu-hisプレートそれぞれに移し37℃で48時間培養し、コロニー形成能を観察した。UR43は野生型p53発現プラスミドにおいてTP53のcDNAの下流に挿入されており、Uraは野生型p53依存性である。野生型p53がp53ドミナント・ネガティブ変異体と接合した場合には、SC-trp-leu-his-uraプレート上でコロニーの形成は抑制される。また、Ura+細胞では5-FOAが5-FUに変換するため細胞は増殖できず、5-FOA含有プレート上でドミナント・ネガティブ変異体と接合したコロニーのみが増殖するため、ドミナント・ネガティブ変異体が同定できる。このようにしてスクリーニングしたドミナント・ネガティブ変異体を哺乳類細胞内でさらに詳細に解析するため同定したドミナント・ネガティブ変異TP53につき、哺乳類細胞用のプラスミドに導入する作業にとりかかっているところである。変異p53発現プラスミドを作成後、野生型p53発現プラスミドとルシフェラーゼレポータープラスミドと共に哺乳類細胞に共発現させルシフェリンを加えた際の発光減少の有無を確認し、酵母細胞内での現象が哺乳類細胞内でも再現されるか否かを確かめる予定である。
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