血中膵癌由来ペプチドの網羅的解析による新規バイオマーカーの探索

2009 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21790658
• Research Institution: Mie University
• Principal Investigator: 山本 憲彦 Mie University, 医学部・附属病院, 助教 (60501963)
• Keywords: 膵癌 / プロテオミクス / バイオマーカー

Research Abstract

現在まで当科に保存されている、膵癌や慢性膵炎の患者血清からタンパクを抽出した。我々は、2D-μHPLC-MALDI-TOF-MS(質量分析計)を用いたハイスループットの検出系をすでに確立しており、この系を用いて解析する。病期が進展するのに伴い、特に低分子のペプチドの発現をプロファイリングした。特に癌化との関連ペプチドに注目した。コントロールとして肝癌患者や他の消化器癌患者関しても検討する。具体的には以下の方法を用いた。
<2D-μHPLC-MALDI-TOF-MS>
血清サンプルを前処置後SCXおよびC18カラムを用いた2D-μHPLCにより6x190=1140の分画に自動装置によってわける(AccuSpot)。それぞれの分画を質量分析計(AXIMA CFR plus: reflectron mode)にかけ、結果をディファレンシャル解析ツールにより解析した。その後に再調整することなくMS^n測定により、タンパク・ペプチドの構造決定をした。これらの一連の過程はすべて自動化で施行している。(自動多次元タンパク質MSプロファイリングシステムを共同で開発した)。本法によって、包括的かっ網羅的なプロテオーム解析が可能になるが、検体処理速度は1週間に2検体が可能である。本研究では特に質量5000以下のペプチドを中心に網羅的に解析する。
この結果多数の疾患特異性ペプチドを同定することが可能であった。現在、同定されたペプチドを解析しその修飾についても検討中である。質量分析計によるタンパクの同定は、ペプチドマスクフィンガープリント法(PMF)とアミノ酸内部配列解析を施行する。具体的には、PMFはタンパク質を特異的切断酵素で処理し、データベースから予想されるペプチドの質量と実測値を比較し、既存のデータベースより同定する。また、アミノ酸内部配列解析は、ペプチド断片をさらにペプチド結合の位置で分解し、アミノ酸内部配列解析を施行する。これにより未知のタンパク質も構造を明らかにすべき研究をすすめている。