miRNAによるRNA干渉効果を用いた新しい血小板遺伝子ノックダウン手法の開発

2009 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21791466
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 加藤 祐子 Kyoto Prefectural University of Medicine, 医学部附属病院, 専攻医 (50398400)
• Keywords: 血小板 / 遺伝子治療

Research Abstract

ヒトCD34+ Progenitor Cellに、miR RNAi発現ベクターを導入後、In Vitroで血小板細胞に分化させる事で、ターゲット遺伝子の発現が抑制され、血小板機能が抑制されるかどうかを確認すること。(In Vitro系)
1. miRNAの作成GPllb, CD62P, Akt, P38αをターゲットにしたmiRNA塩基配列作成は、Invitrogen社でReady MadeのDNA64merの人工miR RNAiインサートを購入した。
2. アニーリング及びクローニングDouble Strandにアニーリング後pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRにクローニングする。
3. 遺伝子導入Heck-293細胞(培養細胞)に導入後、目的の遺伝子がノックダウンされていることを、Real Time PCR(RNAレベル)及び、Flow Cytometry法(タンパクレベル)で確認した。
4. CMV Promoter(又は血小板特異的なGPIbα Promoterを作成後)、及びmiR RNAi entryクローンと共に、BP/LRクローニング反応によりpcDNA6.2-GW/EmGFP-miRよりデステイネーションベクター(pLenti6.4/R4R2/V5-DEST)にmiRNAを組み込む。作成したpLenti6.4/MSGW/EmGFP-miR expression plasmid DNAを293FT cellに感染後、ウィルスのタイターを測定した。
5. 初代細胞採取 ヒトCD34+ Progenitor Cellは末梢血より、採取した。
6. ヒトCD34+ Progenitor Cell及びマウス骨髄細胞が血小板に分化するようサイトカインを含んだ培養液(IMDM with 1.5%BSA, Thrombopoietin, IL-6, IL-1b各10ug/ml, Stem cell factor 50ng/ml)に培養した。
7. 遺伝子導入pLenti6.4/MSGW/EmGFP-miR expression plasmid DNAをヒトCD34+ Progenitor Cell又はマウス骨髄細胞に導入した。
8. 血小板に分化後(約3-4week)、Real Time PCR(RNAレベル)及び、Flow Cytometry法(淡白レベル)で、ターゲットの遺伝子ノックダウンを確認した。以上の結果は、次年度の実験計画が順当に進む可能性を示すものである。