C末端アミド焦点化ペプチドーム解析に基づく新規生理活性ペプチドの同定と機能解析

2009 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21870055
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (Start-up)
• Research Institution: National Cardiovascular Center Research Institute
• Principal Investigator: 若林 真樹 National Cardiovascular Center Research Institute, 薬理部, 室員 (70552024)
• Keywords: 生理活性ペプチド / C末端アミド化 / 抗体アフィニティーカラム / ペプチドーム解析

Research Abstract

当研究室で集積してきた様々なC末端アミド構造認識抗体を用いてアフィニティーカラムを作製し、類似構造を持つ既知のペプチドを用いて、濃縮率や認識特異性に関する基礎的なデータを収集した。次に、新規生理活性ペプチド探索のターゲットとして、ペプチドC末端のアミド化を触媒する酵素PAM(peptidyl-glycine alpha-amidating mono-oxygenase)の発現が見られる組織や、培養細胞を選択し、それぞれペプチドーム解析法に従いペプチド画分を調整した。このペプチド画分を、各抗体アフィニティーカラムに通した後、保持されたペプチドを、ナノ流速逆相LCにより高精度に分離し、MALDI-TOF/TOF tandem MS(ABI4800)・LTQ-Orbitrap(Thermo-Fischer)を用いて解析・同定を包括的に行った。しかし、微量ペプチド同定の障害となるタンパク質分解物の非特異的吸着が予想以上に多く、これらを除去する方法に関して検討を行うこととした。目的のアフィニティーカラムに通す前に、抗体結合前の樹脂や、他の抗体を結合させたカラムに通すことで、調整したペプチド画分から、非特異的吸着物を一部除去することができた。また、アフィニティーカラムに結合させたペプチドを溶出する際、溶出液のイオン強度や有機溶媒濃度を変化させて段階的に分画することで、非特異的吸着物の分離を試みた。吸着物を完全に除去することはできなかったが、微量ペプチドの同定効率を上昇させることに成功した。また、既知のC末端アミド化ペプチドに関し、これまでに報告されていない培養細胞種からの分泌を確認することができた。