2021 Fiscal Year Annual Research Report
クライオ電顕画像から蛋白質の動的構造を描写するための新規計算科学手法の確立と応用
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21H01050
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
中迫 雅由 慶應義塾大学, 理工学部(矢上), 教授 (30227764)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | クライオ電子顕微鏡 / 自由エネルギー地形 / 蛋白質水和構造 / 機械学習 / X線回折・散乱 / 光受容蛋白質フィトクロムB / 光受容蛋白質フォトトロピン２ / 分子動力学計算 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
（１）三次元コンボリューション・フィルターを用い、コンボリューション層と全結合層から構成された八種類の水和構造予測ニューラル・ネットワークを構築した。各々、高分解能低温X線結晶構造から抽出した5,310,762個の局所水和構造パターンを学習させ、テストデータに対する損失関数で学習を評価した。最良の結果をもたらすニューラル・ネットワークを選定し、学習データに含まれない蛋白質の水和構造予測に適用して、予測水和分布確率をX線結晶構造解析の水和構造位置と比較し、満足できる結果を得た。
（２）グルタミン酸脱水素酵素と補酵素混合溶液に対するクライオ電子顕微鏡構造解析を通じて、同酵素蛋白質が補酵素を結合する際に多数の準安定な結合部位間を逡巡しながら最終結合位置に至っていることが観察できた。準安定な結合は、酵素蛋白質の大規模ドメイン運動と強く相関している可能性が示唆された。また、これまでの１０倍以上の電子顕微鏡イメージを異なる装置・条件下で得、ダイナミクスをマニフォールド学習で解析することを目指し、観察像を統合するべく、デフォーカスが異なる観察像を比較して統合の可否を検討した。デフォーカスが異なっていても同じ静電ポテンシャル像が得られたことから、将来の解析に期待が持てた。
（３）植物の光受容蛋白質フィトクロムBとフォトトロピン２について、従来の精製プロトコルを改善し、短時間三ステップでの高純度精製を可能とした。それぞれ結晶化を試み、生じる凝集体中に結晶核が存在しないかを、SPring-8でのX線回折実験で確かめた。フィトクロムBについては、低分解能ではあるが、先に提案したX線小角散乱モデルと一致するクライオ電子顕微鏡三次元構造を得た。フォトトロピン２については、試料凍結時の濃度とｐHを検討する必要があることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本課題では、クライオ電子顕微鏡構造解析に基づいた、蛋白質の立体構造と機能の物理化学的理解に資するべく、立体構造変化経路と自由エネルギーの関係、水和構造予測を実用化し、その有効性を示すことを目的としている。これまでの進捗状況は下記のとおりである。
（１）クライオ電子顕微鏡で得られる蛋白質構造モデルに対する水和構造予測については、三次元コンボリューション・フィルターを用いたニューラル・ネットワークを開発した。このニューラル・ネットワークは、水溶性蛋白質について、結晶構造で明らかにされた内部空隙や第一水和層の水和構造を85%以上の確率で予測でき、分布確率極大は水和水位置の1Å以内であった。
（２）グルタミン酸脱水素酵素と補酵素混合溶液に対するクライオ電子顕微鏡構造解析では、酵素に補酵素が結合する場合、補酵素が直接最終結合位置に至るのではなく、複数の準安定な結合位置を逡巡している可能性が高いことが示唆された。また、大量のクライオ電子顕微鏡画像からそのダイナミクスをマニフォールド学習で分類し、構造空間での分布やエネルギー地形を調べるべく、異なる条件で観察した電子顕微鏡データの統合を検討した。これに関連して、X線回折イメージング構造解析でのデータ処理や解析方法の援用を検討した。
（３）植物の光受容蛋白質フィトクロムBとフォトトロピン２については、従来の精製プロトコルを改善して、これまでで最も純度の高い標品を得ることができるようになった。それぞれについて結晶化を試み、得られた凝集体について、SPring-8にてX線回折実験を実施した。フィトクロムBについては2020年に報告したX線小角散乱モデルと一致する低分解能三次元構造を得ることができている。フォトトロピン２については、溶液の濃度とpHを検討する必要があることが明らかとなった。
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| Strategy for Future Research Activity |
2021年度の結果を踏まえ2022年度は、以下の三項目について研究を推進する。なお、クライオ電子顕微鏡観察およびX線回折・散乱実験はSPring-8において実施する。
（１）機械学習に基づく水和構造予測法の高度化：三次元コンボリューション・フィルターを実装した水和構造学習・予測アルゴリズムを発展させ、水和水分子予測位置精度の向上を図るとともに、膜蛋白質水和構造予測に歩を進める。
（２）自由エネルギー地形解析：昨年度、酵素蛋白質の電子顕微鏡を異なる装置・条件で取得した場合に同じテンシャルマップが得られることが明らかになったので、データ統合を進め、すでに開発・実用化したマニフォールド学習の一つであるDiffusion Map法などを基盤として、自由エネルギー地形を構造空間の多様体上で記述することを試みる。Diffusion Map法は、すでにX線回折イメージング構造解析で用いた実績があり、その解析方法の援用を検討する。
また、酵素が基質結合に至るダイナミクスを検討するための像について可視化できたことから、その詳細な検討に、分子動力学計算を援用して結合とドメイン運動の相関を調べながら、自由エネルギー地形を得るべく研究を進める。
（３）クライオ電子顕微鏡によって確度の高い外形が得られた不活性型フィトクロムBについては、より高分解能でのクライオ電子顕微鏡解析と結晶化を進める。フォトトロピン２では、電子顕微鏡観察に適した精製条件が判明したので、分散性を考慮しながら、クライオ電子顕微鏡観察を進め、結晶化を試みる。これら光受容蛋白質の構造解析において、構造解析が進展すれば、光受容状態での構造解析に歩みを進める。
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