バイオプローブによる細胞核内動的秩序構造の基本原理探索

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21H01051
• Research Institution: Toyo University
• Principal Investigator: 藤井 修治 東洋大学, 食環境科学部, 教授 (40401781)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 細胞核 / 共焦点レオロジー / 動的秩序構造

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は応力場にさらされた細胞核内部の染色体の時空間秩序を維持する基本原理を理解することである。タンパク質バイオプローブを用いで細胞核内部の粘弾性特性を把握しつつ細胞核内の構造体のダイナミクスを包括的に把握するには、レオメーターを用いて制御された応力を細胞に印加しつつ、共焦点顕微鏡で核を観察する必要がある。そこで、初年度は共焦点システムとレオメーターを組み合わせたConfocl Rheometryの構築を最初の達成目標とした。共焦点システム(Yokogawa製CSU-W1)を倒立顕微鏡に取り付け、さらにレオメーターをその上部に取り付けることにより、同システムを完成させた。このシステムを用いることにより、一定応力をゲルに加えつつ変位場を読み取ることにより、物質内部の粘弾性特性を把握するための準備を整えた。また、粒子画像流速測定法(PIV)や牽引力顕微鏡(TFM)による細胞内粘弾性分布抽出のためのソフトウェアをMatlabで構築した。
本研究では、レオメーターで細胞封入ゲルを振動させ、振動刺激を受ける細胞核内部の動的秩序構造の観察も行う計画である。しかし、振動下では細胞が常に観察視野内を振動方向に移動するため、核内部の構造変化を定量的に観察することが困難になってしまうという実験上の問題がある。振動下でも定量的な構造観察を行うことができるように、周期的振動下における画像解析手法の構築にも取り組んだ。本手法では、一定周期で往復運動している構造体内部を観察するため、振動振幅がゼロ点に回帰した瞬間の画像のみを収集・動画化し、PIVやTFMを実施する。振動下では、画像の関心領域が、振動方向だけではなくゲル全体の変形により同心円方向(回転中心)にも変形するため、二軸方向に移動する。この二軸変位を補正し、関心領域内部の動的変化を観察する手法を整えた。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

装置の立ち上げと解析手法の構築は予定通りの進捗であったが、試料である細胞封入ゲルの調整、それに必要な培養液調整試料の納期遅れが生じ、細胞を用いた実験まで進めることができなかった。原因として、Confocal Rheometry装置の構築に2021年度予算のほとんどを使用したことに加え、世界的な調整試薬の不足が挙げられる。特に試薬調達が大幅に遅れたことが停滞の大きな原因となった。

Strategy for Future Research Activity

前年度に準備した倒立顕微鏡と共焦点ユニットにより構成されたConfocal Rheometryを用いて、細胞を封入したゲルを変形させつつ細胞観察を実施する。昨年度中に実施予定であった細胞封入ゲルの調整に改めて取り組む。細胞封入ゲル用のゲル化剤(コラーゲンゲル)はすでに購入済みである。試料調整は外的応力場を細胞に伝達するために重要であるため、慎重に実施する。コラーゲン水溶液を培養さらに流し固め、培養皿上で粘弾性測定の実施が可能であることを確認した後、昨年度中に未達成となっていたEM-CCDカメラを利用した蛍光相関分光測定法を、我々の測定系でも実現させる。今後は、まず初めにゲル中の標準蛍光分子の拡散挙動を観察することにより、Confocal Rheometryによる蛍光相関分光測定法を確立する。
次に、細胞を播種・封入したコラーゲンゲルの観察を実施し、Confocal Rheology測定・解析とCCDカメラ蛍光相関分光測定・解析を行うことにより、 細胞核全体の粘弾性評価をし、計画を進める。 具体的には細胞小器官とバイオプローブの自己拡散挙動が、応力場の有無によってどのように影響を受けるのかを調べる。またバイオプローブ を自己会合させた微小粒子の拡散挙動についても同様に調べる予定である。