2022 Fiscal Year Annual Research Report
Mechanistic study and control of combined toxicity of nano/microplastics and chemicals toward microorganisms
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21H01696
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| Research Institution | Fukuoka University |
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Principal Investigator |
新戸 浩幸 福岡大学, 工学部, 教授 (80324656)
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2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 出芽酵母 / 大腸菌 / 乳酸菌 / ポリスチレン粒子 / 材料/細胞界面 / 粒子付着量 / 細胞膜健全性 / コロニー形成能力 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
「微生物に対する微小プラスチックと合成界面活性剤の複合毒性効果」を「界面現象」として捉え、メカニズム究明を試みた。当該年度では、合成界面活性剤を用いずに、微生物として出芽酵母(真菌の1つ)および大腸菌(グラム陰性細菌の1つ)に、微小プラスチックとして粒子径100 nm程度の正帯電ポリスチレン(PS)粒子に限定して、実験を行った。異なる2種類の微生物に対する正帯電PS粒子の曝露環境として、水溶液中のNaCl濃度5～600 mMに設定した。得られた研究成果の概要を以下に述べる。
出芽酵母の場合、NaCl濃度が低下するにつれて、酵母に対する粒子付着量は増加し、酵母の細胞膜健全性およびコロニー形成能力はともに低下した。すなわち、正帯電PS粒子曝露後の出芽酵母の「細胞膜健全性」および「コロニー形成能力」の低下度合は、「粒子付着量」に比例していた。なお、出芽酵母の大きさは、NaCl濃度の変化に対して一定のままであった。
大腸菌に対して粒子を低濃度で曝露した場合、NaCl濃度が低下するにつれて、大腸菌に対する粒子付着量は増加し、細胞膜健全性は低下した。高濃度で粒子曝露した場合、粒子付着量はNaCl濃度の低下に対して単調増加するのではなく、M字型に変化し100 mM NaClにおいて極小となった。この原因は、大腸菌の大きさがNaCl濃度の低下に対して一定ではなく、V字型に変化し100 mM NaClにおいて極小となったためと考えられる。正帯電PS粒子曝露後の大腸菌の細胞膜健全性およびコロニー形成能力は、出芽酵母の場合と大きく異なり、NaCl濃度100 mM前後(50～150 mM NaCl)において、「粒子付着量」と「コロニー形成能力」の相互関係が逆転するという興味深い現象を見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該年度は微生物として、真菌である出芽酵母(グラム陽性)の他に、大腸菌(グラム陰性細菌の1つ)および乳酸菌(グラム陽性細菌の1つ)を用いた。後者2種類の菌体は小さいため、フローサイトメーター(FCM)測定において、粒子付着した菌体をノイズ(溶液中に残留する菌体デブリ、未付着粒子凝集体など)から識別できるよう、粒子曝露後の菌体サンプルに対して死菌染色剤(ヨウ化プロピジウム, PI)および全菌染色剤(DAPI)を用いて二重染色し、各染色剤の添加順序および最終濃度を最適化した。PI染色に基づく菌体の「細胞膜健全性」の評価に加えて、菌体の「コロニー形成能力」も評価した。具体的には、粒子曝露後の菌体懸濁液について、希釈したサンプルが塗布された寒天培地を24時間培養した後にコロニー計測してcolony-forming unit (CFU)濃度を決定し、DAPIで全菌染色したサンプルをFCM測定して全菌体濃度を決定した後、(CFU濃度)/(全菌体濃度)として「コロニー形成能力」を評価した。
乳酸菌(グラム陽性細菌の1つ)の場合、嫌気的に液体培養する必要があったため、他の菌体を用いた曝露試験と比較すると、曝露試験を効率よく進めることができずに、実験上の課題を解決した時点で当該年度末を迎えてしまった。
微小プラスチックのモデル粒子としてのPS粒子(正帯電・負帯電、粒子サイズなど)を実験者が代わっても再現性よく作製できるよう、合成プロトコルを徹底的に見直した後、手順・条件・試薬レシピなどをプロトコルに詳細に明記して文書化した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究の推進方策について、以下に列挙する：
・微小プラスチックのモデル粒子を、詳細なプロトコルに基づいて、効率的かつ再現性よく合成する。具体的には、負帯電のPS粒子の他、正帯電および負帯電のアクリル樹脂(PMMA)粒子などを合成する。可能ならば、粒子表面に対する界面活性剤の吸着等温線を全有機体炭素計や紫外可視光吸収度測定などによって作成することを鑑みて、当該粒子を大量合成する。
・当該年度において30℃で液体培養した出芽酵母の大きさは8.9μmであったが、前年度までにおいて25℃で液体培養した出芽酵母の大きさは7.8μmであった。富栄養であるYPD培地から貧栄養であるYE培地に代えて30℃で出芽酵母を液体培養すると、厚みが薄くて密度も低い細胞壁をもつ出芽酵母が得られると考えられる。このような出芽酵母は、微小プラスチックを細胞内部に取り込み易いため、微小プラスチックの細胞内動態、その後の細胞増殖時の母・娘細胞間動態などを観察するためのモデル微生物として用いることが期待される。
・負帯電PS粒子は、出芽酵母には付着しない一方で、大腸菌に付着するという研究報告例がある。このため、負帯電PS粒子の曝露後の大腸菌について、「粒子付着量」、「細胞膜健全性」、および「コロニー形成能力」を評価し、これら三者の相互関係がNaCl濃度にどのように影響されるのか検討することは興味深い。
・グラム陽性細菌として、嫌気的に培養する必要がある乳酸菌に代わって、好気的なルテウス菌を用いて、上記と同様な曝露試験を行う。これにより、出芽酵母(真菌の1つでグラム陽性)、大腸菌(グラム陰性細菌)、およびルテウス菌(グラム陽性細菌)に対する微小プラスチックの影響の全体像を解明する。
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