2021 Fiscal Year Annual Research Report
Rational design of artificial metalloenzymes using protein metal complexes
| Project/Area Number |
21H01954
|
|---|
| Research Institution | Osaka Prefecture University |
|---|
Principal Investigator |
藤枝 伸宇 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 教授 (00452318)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
| Keywords | 人工金属酵素 / タンパク質配位子 / 立体分岐型合成 / 不斉反応 / 生体触媒 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、活性中心が柔軟に変化する人為酵素の創製を目指し、第一配位圏や第二配位圏を多様化したタンパク質金属錯体を作製後、効率の高い錯体触媒をスクリーニングしていく。具体的には、タンパク質金属錯体のマイケル付加反応やヘテロDiels-Alder反応などへの活性を観測しながら、触媒活性との相関関係を評価するとともに人為酵素の設計方法を構築する。構造解析や種々分光法で観測の可能な金属中心の位置転位を動的変化の一例として活性との関係に着目し、タンパク質金属錯体を詳細に機能解析していく。本年度では金属結合サイトを様々な配位構造や配位数に変化させ、金属との様々な結合様式によって、位置転位を含めた特異な反応場を構築する。これに加えて、変異導入位置がタンパク質骨格に対して固定されているため、空いた配位座(活性点)の配向も多様化される。つまり、金属中心への基質のアクセス方向も同時に変化させることが可能になると考えられる。本年度では以下、第1段階のライブラリーを構築した。3-Hisモチーフ: 4種、2-Hisモチーフ: 5種に加えて、配位性アミノ酸残基(グルタミン酸、アスパラギン酸)導入による多様化を行った (2-His-1-Glu(12種), 2-His-1-Asp(12種), 1-His-1-Glu(12種), 1-His-1-Asp(12種))。反応としてはベータ不飽和ケトンに対するマイケル付加反応を行い、反応の選択性や効率をスクリーニングした。その結果、グルタミン酸を導入した変異体においてさらなる選択性や収率の向上が見られた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では人為酵素構築のため、金属結合サイトを様々な配位構造や配位数に変化させ、金属との様々な結合様式によって、位置転位を含めた特異な反応場を構築する。金属結合サイトにおける様々な配位構造や配位数の変化により、その金属結合様式に加えて、変異導入位置がタンパク質骨格に対して固定されているため、空いた配位座の基質配向も多様化される。つまり、金属中心への基質のアクセス方向も同時に変化させることが可能になると考えられる。本年度では以下、第1段階のライブラリーを構築した。3-Hisモチーフ: 4種(H52A, H54A, H58A, H92A)、2-Hisモチーフ: 5種 (H52A/H54A, H52A/H58A, H52A/H92A, H54A/H58A, H54A/H92A, H58A/H92A) に加えて、配位性アミノ酸残基(グルタミン酸、アスパラギン酸)導入による多様化を行った (2-His-1-Glu(12種), 2-His-1-Asp(12種), 1-His-1-Glu(12種), 1-His-1-Asp(12種))。そこで本年度ではこれらを配位子とした遷移金属錯体をin situ合成した。反応としてはベータ不飽和ケトンに対するマイケル付加反応を行い、反応の選択性や効率をスクリーニングした。その結果、グルタミン酸を導入した変異体(H58E)においてさらなる選択性や収率の向上が見られた。この変異体について特性評価を行うため、銅と錯体を形成させたあと、Jeffamineを沈殿剤としてハンギングドロップ法にて結晶化を行った。得られた結晶をX線結晶構造解析したところ、銅に由来する電子密度が観測され、導入したグルタミン酸が配位していることが分かった。また、銅の電子密度は少し異方性がみられ、金属中心の位置転移の傾向が見られた。
|
| Strategy for Future Research Activity |
来年度に関しても、金属結合サイトを様々な配位構造や配位数に変化させ、金属との様々な結合様式によって、反応場を構築する。すでに第1段階のライブラリーを構築した。3-Hisモチーフ: 4種(H52A, H54A, H58A, H92A)、2-Hisモチーフ: 5種 (H52A/H54A, H52A/H58A, H52A/H92A, H54A/H58A, H54A/H92A, H58A/H92A) に加えて、配位性アミノ酸残基(グルタミン酸、アスパラギン酸)導入による多様化を行った (2-His-1-Glu(12種), 2-His-1-Asp(12種), 1-His-1-Glu(12種), 1-His-1-Asp(12種))。さらに、配位性アミノ酸残基であるメチオニンやシステインを含む変異体も作成し、さらなる多様化を行う。これら作製した変異体を含め、様々な金属と錯体を形成させ、マイケル付加反応やDiels-Alder反応を用いて、立体選択性を示しながら効率よく触媒するタンパク質金属錯体をスクリーニングする。得られた錯体をX線結晶構造解析し、金属の占有率を決定しながら、ESRやラマン分光法でその占有率の裏付けを行う。
|
