2021 Fiscal Year Annual Research Report
Development of novel RNA manipulation toward for photochemical RNA editing
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21H02076
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| Research Institution | Japan Advanced Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
藤本 健造 北陸先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 教授 (90293894)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | RNA光クロスリンク / RNA編集 / ゲノム編集 / 超高速RNA光架橋 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、新規光応答性人工核酸開発を通して正確なRNA操作を創出し、アップコンバージョン用ナノ粒子を用いるなど長波長励起によるRNA操作を組み込むことで、最終的に細胞内で時空間制御可能な光化学的RNA編集法の確立を目的とする。
本年度は、長波長励起によるRNA操作のための新規光架橋素子メチルピラノカルバゾール（MEPK）の合成に成功した。このMEPKを含むオリゴ核酸の光架橋能を評価したところ、400 nmの光を数秒間照射することにより相補鎖中のチミンと光架橋することを見出した。一方、どれだけ長時間光照射をおこなっても相補鎖中のシトシンと光架橋しないという思いもよらない結果が得られた。この結果の一般性を確認するため、MEPKの周辺配列を変化させた１６種類のオリゴ核酸を用いて光架橋能を解析したところ、チミンとは超高速（秒単位）で光架橋するのに対してシトシンとは全く光架橋しないことを見出した。これまでに開発済みの光架橋素子はシトシンと容易に光架橋することからMEPK固有の反応特性であることを確認した。この光架橋反応はRNA鎖中のシトシンと反応しないことから、正確なRNA操作に向けて重要な反応開発に成功したと考えられる。次にシトシン誘導体（シトシン、メチルシトシン、ヒドロキシメチルシトシン、トリフルオロメチルシトシン）に対して光化学的塩基編集をおこなった。各シトシン誘導体の変換速度と分配係数(LogP)の関係を調べたところ、親水性が高ければ高いほど、塩基変換が速いことを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、長波長励起によるRNA操作に向けた新規光架橋素子メチルピラノカルバゾール(MEPK)の合成及び、シトシン(C)からウラシル(U)へのピンポイントRNA編集にターゲットシトシン周辺環境が与える影響に関する解析をおこなった。ピラノカルバゾールの４位にメチル基をもつメチルピラノカルバゾール(MEPK)を一般的な芳香族骨格形成法として知られるペヒマン縮合を利用して高収率で合成した。さらに、シトシンとは全く光架橋せずチミン特異的に光架橋するという思いもかけない特性をMEPKが有することを見出した。この光架橋反応はRNA鎖中のシトシンとも反応しないことから、正確なRNA操作に向けて重要な反応開発に成功したと考えられる。既に開発済みのシアノビニルカルバゾール誘導体を用いてシトシン(C)からウラシル(U)へのピンポイントRNA編集をおこなった後、今回開発に成功したこのウラシル特異的な光架橋素子(MEPK)を用いれば、化学編集されたウラシルを含むRNAだけに光架橋し保護するような正確なRNA操作が可能と考えられる。次にシトシン誘導体(シトシン、メチルシトシン、ヒドロキシメチルシトシン、トリフルオロメチルシトシン)を用いた塩基編集をおこなった。その結果、シトシンはウラシルへ、メチルシトシンはチミンへ、ヒドロキシメチルシトシンはヒドロキシメチルチミンへ、トリフルオロメチルシトシンはトリフルオロメチルチミンへの変換を確認した。また、各塩基の変換速度と分配係数(LogP)の関係を調べたところ、親水性が高ければ高いほど、変換速度が速いことを明らかにした。以上のことから、おおむね順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
精密な細胞内光化学的RNA編集に向け、引き続きカルバゾール含有グアノシン(GK)誘導体を合成する。グアノシンを原料とし、塩基部分のBz保護、5'位のDMTr保護の後、リンカーを介し、カルバゾールを糖の3'位に導入する。その後、アミダイト化をおこない、DNA合成機によりGK含有オリゴDNAを得る。カルバゾール導入時のリンカーとなるメチレン鎖長を変数とし、シトシンに対して最も光架橋する素子を選別する。光反応部位にカルバゾールではなく、ピラノカルバゾールを導入したGK誘導体の合成もおこなう。GK誘導体含有オリゴDNAとその相補鎖RNAを混合し光照射した後、HPLC解析により光架橋・開裂反応評価をおこなう。また、光架橋したDNAを酵素分解し、シトシンとの光架橋ダイマーを取り出したのち、1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMQCによる構造決定をおこなう。さらに、オフターゲット効果克服に向けて、対合塩基認識能の評価をおこなう。シアノビニルカルバゾールは対合塩基認識能を持たないため、対合塩基がA, T, G, Cいずれの塩基であってもTm値に変化はない。一方、今回合成するGK誘導体は塩基部分に天然塩基を保持しているため、相補的な塩基のみ高いTm値を示すと考えられる。各種熱力学的パラメータ(ΔG, ΔH, ΔS)を評価し、糖2'位の炭素でDNAバックボーンと繋がった歪んだ構造に起因する負の効果とスタッキングによる正の効果が、どのように熱的安定性に寄与して天然DNA-RNA2重鎖の熱的挙動に相似させているのか明らかにする。
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