2022 Fiscal Year Annual Research Report
Development of a system to analyze the intracellular dynamics of TLR4 for the discovery of novel vaccine adjuvants
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21H02080
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
樺山 一哉 大阪大学, 大学院理学研究科, 准教授 (00399974)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
狩野 裕考 東北医科薬科大学, 薬学部, 助教 (40774279)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 自然免疫 / ライブセルイメージング / TLR4 / リポポリサッカライド / フローサイトメトリー / スフィンゴミエリン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度はまず、マウス骨髄由来細胞を単離し、BMDCおよびBMDMに分化させ、それぞれが解析利用に足るものであることを、フローサイトメトリーおよび形態学的に確認した。またこの免疫系細胞にLPSで刺激を行ったところ、マウスマクロファージ様細胞株RAW264.7を比較して、数倍のサイトカイン分泌能を示したことから、リガンド構造のわずかな違いによるサイトカイン放出能の評価を行うのに適している細胞であることを確認した。 但しRAW264.7も簡便に利用できることから引き続きこの細胞も用いて検討を行う。続いて、フローサイトメトリーを用いてTLR4/MD2の細胞内移行の評価系を構築した。抗体には、LPSの結合の有無にかかわらず全てのTLR4を認識するSa15-21、および活性化(リガンド結合し二量体化する）前の単量体TLR4を認識するMTS510を用いた。リガンドには、昨年から引き続きEcLPSおよびRsLPSを用いた他、本研究においてスフィンゴミエリンがその脂肪酸鎖の長さの違いにより活性化能を調節できることが判明したので、これを用いて検討した。その結果、EcLPSおよびRsLPSについては予想通りのTLR4二量体化と内在化の解析結果が得られ、スフィンゴミエリンも同様に、濃度依存的、LPSとの共存によるアゴニスト・アンタゴニスト活性を評価することができた。スフィンゴミエリンについては、HEK-Blue TLR4細胞を用いたSEAPアッセイによるNF-kB活性評価、ならびにIL-6、IL1-βなどの各種サイトカイン放出能のELISAによる評価とほぼ傾向が一致した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ほぼ研究計画の行程で進んでいる。さらに本研究で新たにスフィンゴミエリンが内因性の活性調節リガンドとなりえることも判明したことから、この事象のデータも取得し、結果を充実させていく。
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| Strategy for Future Research Activity |
イメージング、フローサイトメトリーにより、内在化能が比較的異なる分子を選択し、高感度レポーターアッセイも含めて、体系的なデータを取りまとめ、発表および論文化を進める。また、スフィンゴミエリンをリガンドとする研究も加えて、さらに展開していく。スフィンゴミエリンに関しては、TLR4/MD2を介した炎症性サイトカイン分泌経路とは別に、パイロトーシス経路を活性化している結果が得られているため、こちらの経路を評価できる系も構築していく。イメージングについては、所属研究室において完全合成された蛍光標識LipidAが供給される予定であるため、これも併せて評価していく。
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