2021 Fiscal Year Annual Research Report
Studies on a novel control mechanism of cell-cell communication by protein cross-linking of multicellular filamentous fungi
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21H02098
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
丸山 潤一 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 特任教授 (00431833)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 糸状菌 / 麹菌 / 多細胞 / トランスグルタミナーゼ / タンパク質架橋 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
糸状菌は、菌糸状に生育し、隔壁により仕切られた細長い細胞が連なる多細胞生物としての形態的特徴を有する。隔壁には隔壁孔と呼ばれる小さな穴があき、これを介して隣接した細胞どうしで連絡を行っている。この細胞間連絡は、動物のギャップ結合・植物の原形質連絡のような多細胞生物として共通する性質であり、真核生物でもっとも単純な構造で始原的な細胞間連絡である。
本研究では、研究代表者らが大規模局在スクリーニングから見いだした、糸状菌の細胞間連絡の制御因子のなかより、タンパク質の架橋反応を担うトランスグルタミナーゼを対象として、細胞間連絡を制御する機能の解明を目指す。トランスグルタミナーゼの基質同定により、細胞間連絡制御の分子ネットワークの解明を行う。動物で血液凝固や皮膚表皮形成でのタンパク質どうしを架橋する機能が知られるトランスグルタミナーゼについて、本研究は糸状菌の細胞間連絡における制御メカニズムからの新しい生理機能を提起する。
2021年度は、トランスグルタミナーゼ活性が細胞間連絡の制御と関連があるかを調べるため、蛍光顕微鏡による酵素活性の局在の可視化実験を行った。人工基質5-(ビオチンアミド)ペンチルアミンによる架橋反応で基質タンパク質がビオチン化されることを利用して、蛍光物質で標識されたストレプトアビジンを用いてトランスグルタミナーゼ活性の検出を試みた。蛍光顕微鏡観察を行った結果、溶菌時の隔壁孔においてトランスグルタミナーゼ活性の蓄積が観察された。また一方で、溶菌時に隔壁孔に蓄積する「トランスグルタミナーゼ様タンパク質」がもつ推定触媒残基に変異導入を行ったところ、隔壁孔での溶菌の伝播を防ぐ機能が低下した。以上から、隔壁孔での細胞間連絡について、トランスグルタミナーゼ活性が制御することを示唆する結果が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究代表者らは、糸状菌特異的に存在する機能未知遺伝子からのスクリーニングより、細胞間連絡の制御因子を数多く見いだした。そのなかから、タンパク質の架橋反応を担うトランスグルタミナーゼが細胞間連絡を制御する可能性を糸状菌で初めて見いだした。
2021年度は、トランスグルタミナーゼ活性が細胞間連絡の制御と関連があるかを調べるため、蛍光顕微鏡による酵素活性の局在可視化実験を行った。人工基質として5-(ビオチンアミド)ペンチルアミンを使用して、トランスグルタミナーゼ活性により、基質タンパク質のグルタミンのγ-カルボキシアミド基とイソペプチド結合を形成させる。この架橋反応で基質タンパク質がビオチン化されることから、蛍光物質で標識されたストレプトアビジンがビオチンと結合し、架橋反応を検出するための蛍光プローブとして機能する。これにより、トランスグルタミナーゼ活性により架橋されたタンパク質の局在について、蛍光顕微鏡観察で解析した。その結果、溶菌時にトランスグルタミナーゼ活性が隔壁孔に現れることを明らかにした。
また一方で、トランスグルタミナーゼ活性と細胞間連絡制御における機能を検討した。溶菌時に隔壁孔に蓄積する「トランスグルタミナーゼ様タンパク質」がもつ推定触媒残基に変異導入を行った。その結果、隔壁孔での溶菌の伝播を防ぐ機能が低下した。
以上の成果は、隔壁孔での細胞間連絡の制御におけるトランスグルタミナーゼ活性の関与を示唆する、糸状菌で初めての結果である。
前述のとおりトランスグルタミナーゼ活性の局在解析に人工基質が使用できることを示したことから、これを利用して次年度に予定しているトランスグルタミナーゼの基質の同定が期待される。
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| Strategy for Future Research Activity |
2022年度は、トランスグルタミナーゼの基質タンパク質の同定を試みる。菌体を物理的に破砕、もしくはSDSにより溶菌を誘導したのちにタンパク質を抽出する。この際にビオチンが付加された人工基質により、トランスグルタミナーゼの架橋反応で基質タンパク質がビオチン化されることを利用し、ストレプトアビジン結合ビーズを用いて精製する。もしくは、タンパク質どうしの架橋反応により高分子側にシフトした画分を回収する。トリプシンによる消化後、ペプチドをLC/MS/MSで解析、その質量データから麹菌のタンパク質配列データベースを参照して同定する。同定されたトランスグルタミナーゼ基質タンパク質の候補について、GFP融合タンパク質として発現させて溶菌時の隔壁孔への蓄積の有無、遺伝子破壊株を作製して細胞間連絡制御への影響で評価する。
そのうえで、同定されたトランスグルタミナーゼ基質の細胞間連絡における作用機序を解析する。上記のLC/MS/MS解析の結果をもとに、トランスグルタミナーゼ基質において架橋反応を受けるグルタミンを特定し、これに対する変異導入により、細胞間連絡の制御機能、溶菌時やストレス条件の隔壁孔への蓄積における影響を調べる。また、機能予測が可能なものは細胞間連絡制御との機能的関連を検証するとともに、細胞間連絡の状態変化に関連する構造タンパク質としての観点でも作用機序の解析を進める。
同時に、研究代表者が網羅的局在解析で見いだした隔壁孔蓄積タンパク質についても、トランスグルタミナーゼによる架橋反応を受けるかを調べたうえ、上記の基質タンパク質と同様の作用機序の解析を行う。
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