2022 Fiscal Year Annual Research Report
Understanding the core structures and dynamics of membrane protein complexes related in productions of valuable compounds from plants
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21H02115
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
山下 哲 金沢大学, 物質化学系, 准教授 (70361186)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
戸澤 譲 埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (90363267)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 脂溶性有用物質 / メタボロン / X線結晶構造解析 / イソプレノイド / 天然ゴム / フラボノイド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
植物が生産する有用な二次代謝産物は、小胞体膜上で酵素複合体メタボロンの形成により効率的に合成されることが明らかになってきた。他の宿主での代替生産系を構築する上でも、メタボロンの構造と機能を理解することが不可欠である。メタボロンの構成因子同士の相互作用は一般的に弱く、膜上で一過性に形成される複合体の単離も困難である。そのため、複合体の量論比、相互作用、ダイナミクスに関する知見は少ない。本研究ではフラボノイドおよび天然ゴム生合成系を 対象として、代謝酵素複合体の酵素学的解析、質量分析とX線結晶構造解析により、相互作用様式を解明する。さらに高速原子間力顕微鏡を用いて脂質膜上での複 合体の動態を観察し、種々の溶液条件における複合体形成および解離のダイナミクスを明らかにすることを目的とする。
本年度の実績として、植物のフラボノイドメタボロンを構成する縮合酵素と，その活性を調節するパートナータンパク質の複合体の精製をおこない，結晶化とX線結晶構造解析することに成功した。また，同様な組み合わせで高速原子間力顕微鏡の測定を行い，両者が共存する場合の特異な構造形成をとらえることができた。
イソプレノイド生合成経路については，トランス型ポリマーを合成する酵素について，ナノディスク系への組み込みに成功し，膜系と共存した同酵素を高速原子間力顕微鏡で観察した。その結果，膜表面において，二量体を形成すると考えられている酵素が，細動する様子が初めて観察された。また，その挙動は，基質の有無によって顕著に変化することがわかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、懸案であった植物由来のフラボノイド合成酵素とパートナータンパク質の複合体の単離および精製に成功した。この複合体の結晶化条件をスクリーニングすることにより，良質の結晶が得られ，X線回折強度測定実験によって，立体構造決定に必要な全データを収集することに成功した。本成果は，植物メタボロンを構成する複合体としては，初の報告となる見込みであり，現在論文の原稿準備を急いでいる。
また，研究分担者の貢献により、トランス型ポリイソプレノイド合成酵素の触媒本体をナノディスク膜上へ再構成することに成功した。この成果は、主に学会などで発表したが，査読付き国際学術雑誌への投稿も準備が進んでいる。他にも，トマト由来の酵素を改質した酵素の結晶構造決定も行うことができた。以上の酵素学・計算科学・相互作用解析により、メタボロンの複合体構造が初めて解明されたため、本研究計画の最大の目標が達成されたと考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究推進方策として、引き続きフラボノイド生合成系の酵素群からなる複合体を中心に検討を進める。この実験計画については、フラボノイド生合成系の鍵酵素と、その活性調節を担う異性化酵素類似タンパク質を代謝酵素複合体の最小単位(コア構造)とみなして、二つの因子の複合体形成のダイナミクス解明を目標に進めていく。次年度は、引き続きダイズおよびヒメツリガネゴケという由来の酵素およびタンパク質群に加えて，キンギョソウのメタボロン関連タンパクも扱う。これらは、植物進化において興味深い関係にあり，フラボノイド生合成の効率性および多様性について、それぞれのタンパク質間の親和性は異なることが予想されている。次年度は主に，コア構造の共発現系により、 これまでに単離していない複合体の発現・単離を試み、結晶化を検討する。また，イソプレノイド系についても，ナノディスクに導入する系を活用し，高速バイオ原子間力顕微鏡で見られた挙動中に合成されるバイオポリマーの同定を行う。また，これまでに膜上で細動が確認された目的酵素に対して，ポリクローナル抗体を用いて，リアルタイムで酵素に対する結合を観察し，これまでの観察結果をより確かなデータとしてまとめ，論文発表の準備を進める。
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