2021 Fiscal Year Annual Research Report
クチナーゼCut190のCa2+結合に伴う動的構造変化とPET分解分子機構の解明
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21H02120
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University |
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Principal Investigator |
織田 昌幸 京都府立大学, 生命環境科学研究科, 教授 (20318231)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
関口 博史 公益財団法人高輝度光科学研究センター, 回折・散乱推進室, 主幹研究員 (00401563)
沼本 修孝 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 准教授 (20378582)
神谷 成敏 兵庫県立大学, 情報科学研究科, 客員教授 (80420462)
宮ノ入 洋平 大阪大学, 蛋白質研究所, 准教授 (80547521)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 酵素 / PET分解 / 構造機能相関 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
酵素によるPET分解には、PETのガラス転移温度（約70℃）以上の耐熱性が酵素に求められる。本申請者が対象とするクチナーゼ様酵素Cut190は、これまでの研究で熱変性温度85℃以上で、常温でのエステル加水分解活性も維持した変異体の取得に成功した。同変異体を鋳型に、さらに高機能化を進めるとともに、反応条件の検討も進めて、エネルギー負荷の低い、酵素によるPET分解の実用化を目指す。さらに本対象酵素は、Ca2+存在下で活性化するも、Ca2+結合が結合力として他の2価金属イオン結合力より弱く、酵素の構造柔軟性を維持しながら活性化することが示唆されており、酵素の構造機能相関の観点でも興味深い。2021年度は、Cut190の分子内にジスルフィド結合を導入した変異体を鋳型として、これまでに得られた結晶構造情報や、類縁酵素の構造情報などを参考に、各種変異体をデザイン、大腸菌発現系を用いて調製し、各変異体の構造機能を評価した。PET分解に関して、50 mM以上のモノマー回収条件で、27%の分解効率を達成した。またCut190の不活性型変異体と、PET monomer、及びPET trimer との各複合体のX線結晶構造解析に成功し、高分解能の結晶構造を取得した。特にPET trimerのように、芳香環3つとの結合構造の解明は世界初で、対象酵素のPET認識、および加水分解活性機構の理解が進められた。これら一連の立体構造情報に基づき、分子動力学計算も行い、特にCa2+結合に伴う動的構造変化を解析して、活性発現と相関するopen構造とclose構造の変化も、計算結果として再現できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
クチナーゼ様酵素Cut190の変異体Cut190*SS（Q138A/D250C-E296C/Q123H/N202H/S226P/R228S）について、類縁クチナーゼLCC（leaf-branch compost cutinase）とのアミノ酸配列比較に基づき、さらに変異を加えた酵素を大腸菌で発現、精製した。各種変異体の二次構造や熱安定性は、円二色性分散計を用いて解析した。現時点での高機能化レベルとして、70℃、24時間静置後、脂肪族基質に対する37℃での残存活性が75%となり、分子内ジスルフィド結合導入前のCut190に比べて、遥かに向上した。微粉化したPETに対しての分解レベルは、50 mM以上のモノマー回収条件で、27%に達した。またCut190*SS不活性型変異体と、PET monomer、及びPET trimer との各複合体のX線結晶構造解析に成功した。これら立体構造情報に基づき、分子動力学計算を行い、特にCa2+結合に伴う動的構造変化を解析し、open構造とclose構造の変化の観測にも成功した。NMRによる解析に取り組むべく、対象酵素の高発現条件の検討に取りくみ、15Nラベル化試料を取得して、そのNMR多次元測定を行った。DXT解析を行うべく、金ナノ結晶を配位すべき位置の選択と、同変異体の創製も行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
PET分解効率を高める高機能変異体のデザインと創製を、得られた結晶構造情報なども参考に進め、さらにPET分解反応条件、例えば界面活性剤の添加や、300 MPa程度までの加圧の効果も検討する。廃棄プラスチックの環境問題解決に向けて、酵素処理により、PETモノマー回収100 mM以上、分解効率70%以上を目指す。構造基盤情報として、Ca2+結合に伴うCut190のopen構造とclose構造の相互変化が、酵素の構造機能相関の観点からも注目されることから、これらの解析を、NMRやDXT、X線小角散乱や分子動力学計算も駆使して統合的に進める。NMRではシグナルの帰属を行った上で、Ca2+添加に伴うケミカルシフト変化や緩和時間の変化を解析する。またこれまでの結晶構造解析結果、Phe77とPhe81のいずれかがCut190分子の内部で疎水クラスターの形成に関わるかでopen構造とclose構造を形成することから、これら各部位の変異体も作成して、その活性や熱安定性を評価し、さらに結晶構造解析やNMR、DXT、X線小角散乱なども用いて、酵素の構造機能相関の解明を進めたい。弱い金属イオン結合が、如何に酵素の構造機能を制御するか、他の同様酵素も対象として、熱測定や結晶構造解析を行い、解析を進める。既存の方法論で観測できる安定な構造だけでは知りえない情報への、新たなアプローチ方法も考えていきたい。
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