2023 Fiscal Year Annual Research Report

Development of analytical method for DNA hydroxymethylcytosine and biological significance of hemi-modification of cytosine.

Research Project

Project/Area Number	21H02154
Research Institution	University of Yamanashi
Principal Investigator	幸田尚山梨大学, 大学院総合研究部, 教授 (60211893)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	志浦寛相山梨大学, 大学院総合研究部, 助教 (10451907)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	ヒドロキシメチルシトシン / メチルシトシン / エピゲノム解析
Outline of Annual Research Achievements	我々はメチルシトシン(mC)の脱メチル化反応に関わることが明らかになったヒドロキシメチルシトシン(hmC)を、mCや非修飾のシトシン(C)と同時に高精度に解析する独自の手法をEnIGMA(Enzyme-assisted Identification of Genome Modification Assay)法と名付け、開発を行ってきた。すでに我々が開発してきたEnIGMA法では哺乳類のDNAメチル化酵素であるDNMT1の持つ基質特異性を用いてmC、hmCおよびCを同時に解析することを可能とした。既存のhmCの解析法であるTAB-seq法や我々の開発したEnIGMA法の解析精度は95%程度であるが、哺乳類ゲノムの中でのhmCの存在比率がCpGのシトシンの数%程度であることから、ゲノムワイド解析においては十分ではないと考えられる。そこで本研究では新たに考案した酵素反応の組み合わせによってmC、hmCおよびCの同定を行い、解析精度を99%以上とすることを目指して条件検討を行った。種々の反応条件の至適化を行い、新たに考案した手法でも十分mC、hmCおよびCの同時解析が可能であることを明らかにし、EnIGMA ver.2としてゲノムワイドの解析への適用を試みた。本研究ではこれに加えてこれまでは片鎖ずつしか解析できなかった手法を、DNAの2本鎖を同時に解析が可能になるようEnIGMA ver.2の改良を行いEnIGMA ver.3として確立することにより、あまり考慮されてこなかった「ヘミ修飾」も含め、シトシン修飾の生物学的意味を明らかにすることを目指した。 EnIGMA ver.3ではver.1、ver.2と比較してより長いヘアピン状のDNAを変性、PCR増幅することが必要であり、十分な解析精度を得るためには更なる条件検討が必要であることが明らかとなった。
Research Progress Status	令和5年度が最終年度であるため、記入しない。
Strategy for Future Research Activity	令和5年度が最終年度であるため、記入しない。